Спосіб виявлення рнк американського та європейського генотипів високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу н7 та диференціація за геном гемаглютиніну

Спосіб виявлення РНК Американського та Європейського генотипів високопатогенного вірусу 3 Європейського генотипу, та Aiv H7 (Am) до Американського генотипу за температури відпалу 54°С і синтезу фрагменту довжиною 641 п.н. до Європейського, та 284 п.н. до Американського генотипу, щоб забезпечити ефективність способу. Спосіб виконується наступним чином. Пробопідготовка. Як матеріал для дослідження використовують змиви з клоаки та глотки від інфікованих тварин, гомогенати внутрішніх органів, периферійну кров, стабілізовану цитратом натрію або розчином глюкози, а також культуральні розплодки вірусу. Ізоляцію вірусної РНК можна проводили за допомогою комерційного набору «РИБО-сорб-50» або «Набір для екстракції РНК» виробництва «Центрального науково-дослідного інституту епідеміології» (Росія). Процедура складається із лізису клітин та їх детриту, сорбції РНК на сорбенті, кількаразове відмивання сорбованої РНК та екстракції РНК із сорбенту за допомогою ТЕ-буферу. Виділені зразки РНК було використано як матрицю для напрацювання кДНК. Реакцію зворотної транскрипції (РЗТ) проводили за допомогою ревертази виробництва фірми Fermentas (Латвія) та набору «Реверта-L» виробництва «Центрального науково-дослідного інституту епідеміології» (Росія). Ампліфікація. Готують загальну (для усієї кількості проб) суміш реагентів для ампліфікації з розрахунку (на 1 пробу): 2,5мкл10хРСR; 0,75мкл полімерази; 4мкл суміші dNTP по 1,76 mM кожного; по 10 рМ праймерів Aiv H7 (Еи) та Aiv H7 (Am); 1мкл 50mM MgSO4; до 20мкл деіонізованої води. Одержану суміш ретельно перемішують на вертексі, після чого/її у дозі 20мкл вносять в усі пробірки підготовлені для ампліфікації. Для проведення ампліфікації у відповідну пробірку з реакційною сумішшю вносять 5мкл розчину сумарної кДНК проби. Для негативного контрольного зразку в пробірку вносять - 5мкл деіонізованої води, а в пробірку для позитивного контрольного зразку 5мкл розчину к ДНК з інактивованої формаліном культуральної розплодки вірусу грипу субтипу Н7. Пробірки закривають й центрифугують протягом 35 секунд при 2000об/хв на мікроцентрифузі. Пробірки переносять в програмний термостат (ампліфікатор) і проводять ампліфікацію за наступною програмою (табл.): Після закінчення реакції проводять аналіз продуктів ПЛР, шляхом поділу фрагментів ДНК в 1,5% агарозному гелі. Потім проводять електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР. Приготування робочого розчину буфера (ТБЕ) для електрофорезу. До мірної колби ємністю 1000,0см3 вносять вміст пакета з буфером для електрофорезу, доводять до мітки дистильованою водою та ретельно перемішують до повного розчинення осаду. Приготування агарозного гелю. У конічну колбу ємністю 250см3 вносять вміст одного пакета (1,5г) з агарозою, додають 100,0см3 робочого роз 42434 4 чину буфера ТБЕ і ставлять колбу на водяну баню. Вміст колби доводять до кипіння, повністю розтоплюють, помішуючи скляною палочкою та охолоджують до температури 50-60°С. Отриманий розчин агарози повинен бути прозорим і не вміщувати окремих нерозчинених часток. Після чого у колбу з розчином агарози вносять 50,0мкл розчину броміду етидія. Підготовка електрофоретичної камери до заливання агарозного гелю. Встановлюють гребінку на платформу, розміщуючи її на відстані 3см одна від одної та заливають у неї охолоджену до температури 50°С агарозу . Після застигання агарози (приблизно через 25-30хв.) обережно витягають гребінку; платформу з агарозним гелем переносять до електрофоретичної камери. В електрофоретичну камеру заливають необхідну кількість розчину буфера ТБЕ так, щоб він покривав агарозний гель шаром завтовшки 4-5мм.. Для нанесення проби відбирають у кількості 10мкл продукту ампліфікації та вносять у відповідну лунку агарозного гелю, під шар буфера ТБЕ так, щоб вміст одного кармана агарозного гелю не перетікав у інший. Електрофорез проводять у градієнті напруги 8В/см. Потім виймають платформу з агарозним гелем з електрофоретичної камери, дають рідині стекти з гелю та промивають агарозний гель дистильованою водою у кількості 200см3 2-3 рази. Агарозний гель вміщують на скло УФтрансілюминатору.. Фрагменти аналізованої ДНК виявляються у вигляді смужок жовтогарячого кольору при проходженні УФ-випромінювання з довжиною хвилі 260 або 310нм. Облік результатів. У негативному контрольному зразку (К-) смужки мають бути відсутні. Поява смужки на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору. У позитивних контрольних зразках (К+) має бути присутня одна смужка жовтогарячого кольору розміром 641 нуклеотидний залишок (н.з.), що свідчить про наявність в пробі вірусу Європейського генотипу або 284 н.з., що свідчить про наявність в пробі вірусу Американського генотипу у залежності від типу зразка. Відсутність смужки жовтогарячого кольору на рівні позитивного контролю (К+) свідчить про відсутність вірусу грипу. Наявність смужки, що відповідає за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю (641 п.н.), свідчить про присутність вірусу грипу Європейського генотипу, а (284 п.н.), свідчить про присутність вірусу грипу Американського генотипу. Результат аналізу не можна вважати достовірним, якщо на доріжці будь-якого негативного контролю виявляється специфічна смужка. Необхідно поставити не менше трьох негативних контролів на етапі виділення РНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР для виявлення джерела контамінації. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1. Для оцінки чутливості та відтворюваності способу щодо індикації РНК вірусу грипу птиці субтипу Н7 досліджували проби польового 5 42434 ізоляту вірусу грипу Європейського генотипу, що позитивно (16 проб) та негативно (16 проб) реагували в реакції гемаглютинації. Результати досліджень наведені в таблиці 2. Дослідження були проведені триразове, при повтореннях результати відтворені. Приклад 2. Для визначення специфічності способу було використано 10 позитивних проб вірусу грипу Європейського генотипу, 2 - щодо Американського генотипу і 5 - негативних. Для контролю внутрішньовидової специфічності способу використовували зразки кДНК вірусу грипу субтипу Н1-Н14. Після ампліфікації встановлено наявність специфічних смуг різної інтенсивності у всіх 10 пробах Європейського генотипу, а також в треку позитив 6 ного контрольного зразку кДНК вірусу грипу птиці субтипу Н7 довжиною 641 п.н. З негативними пробами кДНК після ампліфікації не утворювалось смуг ампліконів. У двох зразках з вірусом Американського генотипу виявлено утворення специфічних смуг довжиною 284 п.н. Проби сумарної ДНК гетерологічних контролів також не утворювали специфічних смуг після реакції за способом, що пропонується. Розроблено спосіб виявлення РНК високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 та диференціації між американським та є європейським генотипами за допомогою ПЛР, який може успішно використовуватись у практиці лабораторних досліджень. Таблиця 1 Спосіб виявлення РНК американського та європейського генотипів високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 та диференціація за геном гемаглютинину № циклу 1 Температура 94°С 94°С 54°С 72°С 72°С 2 3 Час 5 хв. 40 сек. 40 сек. 1 хв. 10 хв. Кількість циклів 1 40 1 Таблиця 2 Спосіб виявлення РНК американського та європейського генотипів високопатогенного вірусу грипу птиці субтипу Н7 та диференціація за геном гемаглютинину Метод дослідження РГА ПЛР (Aiv Н7 (Eu)) Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Позитивно реагуючі проби n = 16 з них 1:2 n = 2 1:32 n = 2 1:64 n = 4 1:128 n = 4 1:256 n = 4 n = 17 Підписне Негативно реагуючі проби n = 16 n = 15 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601