Спосіб кріоконсервування меристем сільськогосподарських рослин

Реферат: Спосіб кріоконсервування меристем сільськогосподарських рослин включає їх інкубування у розчині сахарози і охолодження над дзеркалом рідкої фази азоту з подальшим зануренням у рідкий азот, причому охолодження проводять у два етапи, причому на першому етапі охолодження здійснюють на відстані 50 мм, а на другому етапі - на відстані 20 мм до дзеркала рідкої фази азоту. UA 100791 U (12) UA 100791 U UA 100791 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі кріобіології і може бути використана у різних напрямках біотехнології рослин, сільському господарстві для цілей зберігання генетичного матеріалу рослин та їх селекції. Відомі способи кріоконсервування меристеми різних видів сільськогосподарських рослин, які базуються на вітрифікації та дегідратації з використанням кріозахисних середовищ, і охолодженні шляхом занурення матеріалу у рідкий азот [1, 2, 3]. Суттєвим недоліком таких способів є використання середовищ, у яких загальна концентрація кріопротекторів (гліцерину, етиленгліколю, диметилсульфоксиду, сахарози) становить не менш 50-60 %, що приводить до значного зневоднення клітин меристематичних тканин, спричиняючи таким чином їх ушкодження і зниження процента життєздатних меристем [4]. Такі способи потребують тривалого (120-180 хв) контакту біоматеріалу з кріопротекторними речовинами, які, як і всі хімічні агенти, впливають у великій мірі на біологічну структуру, у деяких випадках спричиняючи пошкодження молекул ДНК, що може призводити до змін у генетичному апараті клітин [5, 6, 7]. Найближчим до способу, що заявляється, є спосіб кріоконсервування меристем часнику [8]. Згідно зі способом меристеми культивують впродовж 5 діб на поживному середовищі Murashige & Skoog (MS) з вмістом сахарози 0,3 М, потім інкубують протягом 35 хв у кріозахисному середовищі, що містить розчин кріопротекторних речовин (1,2-пропандіол, метилацетамід, поліетиленоксид, полівінілпіролідон). Далі меристеми переносять до стерильних контейнерів, що герметизуються, і охолоджують над дзеркалом рідкої фази азоту на висоті 35-50 мм протягом 10-15 хв, після чого контейнери занурюють у рідкий азот. Відігрів здійснюють у повітряному середовищі при кімнатній температурі до повного відтавання. Відігріті меристеми відмивають від кріопротекторів шляхом двократної зміни поживного середовища MS. Недоліком цього способу є використання кріопротекторних речовин різної природи, які, навіть у невеликій концентрації, пошкоджують клітинні структури, зокрема структури ядерного апарату, що призводить до змін у геномі. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити відомий спосіб кріоконсервування меристем сільськогосподарських рослин таким чином, щоб за рахунок оптимізації процесу охолодження можна було відмовитися від використання кріозахисних середовищ на основі синтетичних кріопротекторних речовин, завдяки цьому уникнути контакту тканин з хімічними агентами у процесі кріоконсервування, і забезпечити отримання матеріалу з ядерним апаратом та геномом, що не зазнали ушкоджень від дії хімічних речовин. Ця задача вирішується тим, що у способі кріоконсервування меристем, який включає інкубування їх у розчині сахарози і охолодження над дзеркалом рідкої фази азоту з подальшим зануренням у рідкий азот, відповідно до корисної моделі, охолодження проводять у два етапи, причому на першому етапі охолодження здійснюють на відстані 50 мм, а на другому етапі - на відстані 20 мм до дзеркала рідкої фази азоту. Заявлений спосіб, за рахунок оптимально підібраного температурного режиму охолодження, дозволяє відмовитися від використання кріопротекторних речовин, які є токсичними, і уникнути їх негативного впливу на клітини меристеми. Це дає можливість отримувати генетичний матеріал, що не зазнав ушкоджень від дії хімічних речовин, і у подальшому використовувати його з ціллю підтримання генетичних колекцій існуючих сортів (клонів, ліній) та виведення нових сортів сільськогосподарських рослин. Спосіб здійснюють таким чином. Меристеми після виділення культивують 5 діб на стандартному поживному середовищі MS з вмістом сахарози 0,08 М. Далі їх переносять до 0,8 М розчину сахарози і інкубують при кімнатній температурі впродовж 15 хв. Після цього меристеми поміщають у стерильні контейнери, які герметизуються, і охолоджують у парах азоту у два етапи, з часовою зупинкою впродовж 10 хв на кожному етапі. На першому етапі відстань до дзеркала рідкої фази азоту становить 50 мм, на другому етапі - 20 мм. Після охолодження у парах азоту контейнери занурюютьу рідкий азот. Відігрівають у повітряному середовищі при кімнатній температурі до повного відтавання. Приклад. Зубки часнику, що знаходились у стані спокою, черенки винограду та картоплі на стадії 3-х листочків дезінфікували, після чого з них в стерильних умовах виділяли меристеми на стандартне поживне середовище MS з вмістом сахарози 0,08 М. Культивування здійснювали за стандартних умов [9] впродовж 5 діб. Після цього відбирали життєздатні меристеми для подальшого кріоконсервування. Для підготовки меристем до охолодження їх переносили до 0,8 М розчину сахарози на поживному середовищі MS, у якому інкубували впродовж 15 хв при кімнатній (22÷24 °C) температурі. 1 UA 100791 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Після інкубування меристеми поміщали в полімерні плівкові контейнери типу мішка, які герметизували шляхом зварювання. Охолоджували контейнери у парах азоту у два етапи, в процесі охолодження зменшуючи відстань до дзеркала рідкої фази азоту: на першому етапі охолодження здійснювали на відстані 50 мм до дзеркала рідкої фази впродовж 10 хв, на другому етапі - на відстані 20 мм впродовж 10 хв. Після охолодження у парах азоту контейнери занурювали у рідкий азот для довгострокового зберігання. Відігрів матеріалу здійснювали у оточуючому повітряному середовищі з кімнатною температурою повітря до повного відтавання матеріалу. Після цього меристеми переносили на стандартне поживне середовище MS з вмістом фітогормонів (кінетин - 1 мг/л, індолілоцтова кислота - 1 мг/л) і витримували у темряві протягом 24 годин. Подальше культивування меристем проводили за стандартних умов [9]. Збереженість кріоконсервованих меристем оцінювали за допомогою метода мікроскопії. Меристеми, які після розморожування набували зеленого забарвлення і виявляли позитивну динаміку росту протягом 15 днів культивування на поживному середовищі, вважали збереженими. У прототипі кількість збережених меристем знаходиться у межах 90 %. У способі, що заявляється, збереженість меристем є на рівні 95 %. Таким чином, процент збереженості кріоконсервованих меристем часнику, картоплі, винограду є не нижчим, ніж у прототипі. Джерела інформації: 1. Кіm Н-Н., Popova E., Shin D-J., Yi J-Y., Кіm С, Lee J-S. Cryobanking of Korean Allium germplasm collections: results from a 10 year experience // Cryo-Letters. - 2012. - Vol. 33. - P. 45-57. 2. Marcovic Z., Chatelet P., Preiner D., Sylvestre I. Effects of shooting medium and source of material on grapevine (Vitis vinifera L.) shoot tip recovery after cryopreservation // CryoLetters. - 2014. - Vol. 35, № 1. - P. 40-47. 3. Wang В., Wang R-r., Li J-w., Ma Ya-l. Development of three vitrification-based cryopreservation procedures for shoot tips of china's potato // CryoLetters. - 2013. - Vol.34, № 4. - P. 369-380. 4. Grospietsch M., Stodulkova E., Zamecnik J. Effect of osmotic stress on the dehydration tolerance and cryopreservation of Solarium tuberosum shoot tips // CryoLetters. - 1999. - Vol. 20, № 6. - P. 339-346. 5. Harding K., Staines H. Biometric analysis of phenotypic characters of potato shoot-tips recovered from tissue culture, dimethyl sulphoxide treatment and cryopreservation // CryoLetters. 2001. - Vol.22, № 4. - P. 255-262. 6. Harding К., Benson E.E. The use of microsatellite analysis in Solarium tuberosum L. in vitro plantlets derived from cryopreserved germplasm // CryoLetters. - 2001. - Vol. 22, № 3. - P. 199-208. 7. Harding K. Genetic integrity of cryopreserved plant cells: a review // CryoLetters. - 2004. - Vol. 25, № 1. - P. 3-22. 8. Пат. України № 79464, МПК A01N 1/02, публ. 25.04.2013. 9. Зубко М.К., Кириченко И.В., Кускова В.Б. и др. Методы культивирования растительных объектов in vitro - К.: Препринт / АН УССР, Институт ботаники, 1988. - 37 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб кріоконсервування меристем сільськогосподарських рослин, який включає їх інкубування у розчині сахарози і охолодження над дзеркалом рідкої фази азоту з подальшим зануренням у рідкий азот, який відрізняється тим, що охолодження проводять у два етапи, причому на першому етапі охолодження здійснюють на відстані 50 мм, а на другому етапі - на відстані 20 мм до дзеркала рідкої фази азоту. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2