Спосіб одержання транс-фукоксантинолу

Реферат: UA 101365 C2 (12) UA 101365 C2 Винахід належить до способу одержання транс-фукоксантинолу із кристалічного фукоксантину, який включає застосування ліпази, отриманої з підшлункової залози свині, розчинення фукоксантину в етиловому спирті до повного розчинення, введення альбуміну та хлористого кальцію у розчин, витримування суміші 5-10 годин при наступному співвідношенні компонентів, г: спиртовий 10 % розчин0,8-8,0 кристалічного фукоксантину ліпаза, виділена з підшлункової0,01-0,5 залози свині 4 % розчин хлористого кальцію 1,0-10,0 альбумін 0,01-0,1 фосфатний буфер 105-525. UA 101365 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до області біохімії й біотехнології й призначений для одержання фукоксантинолу. Фукоксантин і фукоксантинол - природні каротиноїди з унікальними хімічними формулами, що включають практично всі функціональні групи (аленову, епокси-, кєто-, окси-, ацетатну (фукоксантин), карбоксильну (фукоксантинол), сполучені й несполучені подвійні зв'язки). Фукоксантин - самий масовий на планеті пігмент, що входить до складу бурих водоростей, багато видів яких є їстівними. Фукоксантинол - основний метаболіт фукоксантину, що утворюється під дією ферментів в організмі, має в 1,5-2 рази більшу біологічну активність за вихідний каротиноїд [1-3]. Фукоксантинол, на відміну від фукоксантину, практично не міститься в природних джерелах, тому його одержують штучним шляхом з фукоксантину. Відомий спосіб одержання фукоксантинолу з фукоксантину [4], що передбачає чотири стадії. На першій стадії 0,5 г фукоксантину розчиняють в 300 мл метанолу, додають 2,5 г таурохелату до повного розчинення. На другій стадії розчин, що утворився, упарюють досуха. Далі (третя стадія), залишок розчиняють в 500 мл 0,1 М калій-фосфатного буферу, додають 10 г ліпази, отриманої з панкреази, і розчин, що утворився, витримують при температурі 37 °C протягом 2 годин. Одержаний фукоксантинол очищують за допомогою колонкової хроматографії. Процес отримання фукоксантинолу досить тривалий і містить багато стадій, що може приводити до втрат пігментів. Так, упарювання 300 мл розчину фукоксантинолу з таурохелатом на 2-й стадії відомого способу повинне відбуватися у вакуумі; у противному випадку, можливі значні втрати лабільного до нагрівання фукоксантину і його ізомеризація. Крім того, автори патенту не вказують, який із ізомерів фукоксантину був використаний, і які ізомери фукоксантинолу й з яким виходом утворюються в результаті. В основу винаходу "Спосіб одержання транс-фукоксантинолу" поставлена задача детального уточнення технології й забезпечення високого виходу кінцевого продукту. Поставлена задача вирішується таким чином. У пропонованому способі вихідний фукоксантин одержують із чорноморської цистозіри відповідно до відомого способу (5). Після перекристалізації з діетилового ефіру - гексану, за даними HPLC, UV-VIS, H'MR, фукоксантин складається на 93,3 % із транс-фукоксантину й 6,7 % цис-фукоксантину. Кристалічний фукоксантин піддають гідролізу, використовуючи ліпазу, отриману з підшлункової залози свині, як емульгатор застосовують альбумін і хлористий кальцій. У результаті одержують трансфукоксантинол, що складається на 100 % із транс-ізомеру, вихід - 72 82 %. У розробленому авторами способі стадія упарювання розчину, що утворився, не передбачається, що в цілому спрощує технологію. Крім того, спосіб одержання фукоксантинолу із кристалічного фукоксантину відрізняється високим виходом і використанням вітчизняної сировини й реактивів. Експериментальними дослідженням, що виконані авторами, встановлено, що: - застосування ліпази, отриманої з підшлункової залози свині, доцільно в межах 0,01-0,5 г; - кристалічний фукоксантин в межах 0,8-8,0 г треба розчиняти в етилювому спирті до повного розчинення; - введення в розчин фукоксантину альбуміну в межах 0,01-0,1 г хлористого кальцію в межах 1,0-10,0 г з використанням фосфатного буферу в межах 105-525 г є оптимальним, а витримання суміші 5-10 годин є доцільним. Перерахована сукупність істотних ознак є достатньою для досягнення поставленої технічної задачі. Приклад 1 0,1 г кристалічного фукоксантину розчиняли в 1 мл (0,8 г) етилового спирту в атмосфері аргону. До 100 мл (105 г) фосфатного буферу (0,1 М, рН=6,86) при перемішуванні додавали 0,01 г альбуміну, 1,0 мл (1 г) 4 % розчину хлористого кальцію, 0,25 г ліпази й спиртовий розчин фукоксантину. Суміш витримували при 37 °C протягом 5 годин. Каротиноїди екстрагували 2 рази по 50 мл хлороформом. Хлороформний екстракт промивали водою й упарювали у вакуумі при температурі нижче 30 °C. Залишок хроматографували на препаративних пластинках із силікагелем (товщина шару 0,5 мм) у системі ацетон - гексан (1:1). Фракції фукоксантинолу екстрагували ацетоном, упарювали у вакуумі й перекристалізовували із суміші діетиловий ефір - ацетон - гексан. Вихід склав 82 %. За даними H'NMR, отриманий фукоксантинол складається на 100 % із транс-ізомеру. Приклад 2 1,0 г кристалічного фукоксантину розчиняли в 10 мл (8 г) етилового спирту в інертній атмосфері. До 500 мл (525 г) фосфатного буферу (0,1 М, рН=6,86) при перемішуванні додавали 0, 1 г альбуміну, 10 мл 4 % розчину хлористого кальцію, 0,5 г ліпази й спиртовий розчин фукоксантину. Суміш витримували при t=37 °C протягом 10 годин. Каротиноїди (суміш фукоксантину й фукоксантинолу) екстрагували 2 рази по 100 мл хлороформом. Хлороформний 1 UA 101365 C2 5 10 15 20 25 екстракт промивали водою й упарювали у вакуумі при температурі нижче 30 °C. Залишок хроматографували на препаративних пластинках із силікагелем (товщина шару 0,5 мм) у системі ацетон - гексан (1:1). Фракцію фукоксантинолу екстрагували ацетоном і упарювали у вакуумі. Залишок перекристалізовували із суміші ацетон - діетиловий ефір - гексан. Вихід склав 77 %. За даними H'NMR, отриманий фукоксантинол складався на 100 % із трансу-ізомеру. Перевагами способу одержання транс-фукоксантинолу із кристалічного фукоксантину є спрощення технології і можливість використання вітчизняної сировини й реактивів з забезпеченням високого виходу кінцевого продукту. Джерела інформації, прийняті до уваги: 1. Konishi I. Halocynthiaxanthin and fucoxanthinol isolated from Halocynthia roretzi induce apoptosis in human leukemia, breast and colon cancer cells / I. Konishi, M. Hosokawa, T. Sashim a et al. // Соmр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol.-2006.-142 (1-2). - P. 53-59. 2. Sachindra N.M. Radical scavenging and singlet oxygen quenching activity of marine caroteno id fucoxanthin and its metabolites / N.M. Sachindra, E. Sato, H. Maeda et al. // J. Agric Food Chem.2007.-55 (21). - P. 8516-8522. 3. Sugawara T. Antiangiogenic activity of brown algae fucoxanthin and its deacetylated product, fucoxanthinol / T. Sugawara, K. Matsubara, R. Akagi // J. Agric. Food Chem.-2006.-54 (26). - P. 98059810. 4. Pat. Int. Appl. No. PCT/JP2006/321659 Japan. Process for production of fucoxanthinol / Miyashita K., Hosokawa M, Sashima Т., Sasaki Т.; Nat. Univ. Corpor. Hokkaido Univ.; Priority data 2005-340997, 25.11.2005; Publ. data 31.05.2007, Pub. No. WO/2007/060811. 5. Пат. № 26996, UA, МПК C12Р 23/00, C09B 61/00, C12R 1:89. Спосіб одержання фукоксантину з водорості цистозіри / Нехорошев М.В. (UA); заявник Інститут біології південних морів ім. О.О. Ковалевського НАН України (UA). -№ 93007292; Заявл. 06.08.93, Опубл. 28.02.2000. Бюл. № 1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 Спосіб одержання транс-фукоксантинолу із кристалічного фукоксантину, що включає розчинення фукоксантину, додавання розчину фукоксантину до буферного розчину й одержання фукоксантинолу за допомогою ферменту ліпази, який відрізняється тим, що застосовують ліпазу, отриману з підшлункової залози свині, фукоксантин розчиняють в етиловому спирті до повного розчинення, у розчин уводять альбумін і хлористий кальцій як емульгатор, витримуючи суміш 5-10 годин при наступному співвідношенні компонентів, г: cпиртовий 10 % розчин 0,8-8,0 кристалічного фукоксантину ліпаза, виділена з підшлункової0,01-0,5 залози свині 4 % розчин хлористого кальцію 1,0-10,0 альбумін 0,01-0,1 фосфатний буфер 105-525. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2