Спосіб виділення залишкових в-лімфобластів серед елементів гемопоезу, що відновлюється

Реферат: Спосіб виділення залишкових В-лімфобластів серед елементів гемопоезу, який відновлюється, заснований на урахуванні параметрів світлорозсіювання (FSC/SSC). Враховують показники інтенсивності флюоресценції загальнолейкоцитарного антигену CD34 в сполученні з параметрами бокового світлорозсіювання (CD19/SSC). UA 81406 U (54) СПОСІБ ВИДІЛЕННЯ ЗАЛИШКОВИХ В-ЛІМФОБЛАСТІВ СЕРЕД ЕЛЕМЕНТІВ ГЕМОПОЕЗУ, ЩО ВІДНОВЛЮЄТЬСЯ UA 81406 U UA 81406 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до онкогематології, і може бути використана для виділення популяції злоякісно трансформованих клітин. В регенеруючому після антилейкемічної терапії кістковому мозку пацієнта можуть бути 10 присутніми до 10 залишкових пухлинних клітин, ідентичних як морфологічно, так і за параметрами світлорозсіювання з нормальними кістково-мозковими попередниками гематогенами. Під час лікування В-гострого лімфобластного лейкозу гематогени заселяють кістковий мозок, що відновлюється, і потенціально помилково можуть бути враховані як резидуальні бласти. Ремісія рахується досягнутою, якщо кількість бластних клітин (врахованих морфологічно), не перевищує 5 %. Неможливість методом світлової мікроскопії розрізнити гематогени і залишкові пухлинні клітини може привести до виникнення рецидиву у пацієнтів з неповною елімінацією пухлинних клітин. Існуючі методи визначення бластних клітин засновані на даних щодо їх розмірів і гранулярності. В проточній цитометрії це характеризується параметрами світлорозсіювання (пряме (FSC)/бокове(SSC)). Аналогом є спосіб ідентифікації за параметрами FSC/SSC [1]. Найбільш близьким способом виділення залишкових В-лімфобластів серед елементів гемопоезу, що відновлюється, узятим як прототип, є спосіб з використанням аналізу рівня експресії CD 19 в сполученні з боковим світлорозсіюванням (CD19/SSC) [2]. Недоліком існуючого способу є той факт, що після обмеження за параметрами світорозсіювання кластера клітин, що нас цікавить, дуже важко розділити залишкові бластні клітини і гематогени І стадії розвитку, тому що при однаковій експресії CD 19 обидві популяції також мають схожі параметри за логарифмічною віссю SSC. А при наявності перехідних форм, виділений за параметрами CD19/SSC регіон стає гетерогенним, тому ідентифікувати і підрахувати пухлинні та істинні клітини-попередники стає ще більш важко. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб виділення В-лімфобластної популяції на підставі показників інтенсивності флюоресценції маркера CD34 в комбінації з CD19/SSC, що дозволить чітко ідентифікувати залишкові В-лімфобласти. Поставлена задача вирішується тим, що при дослідженні зразків кісткового мозку у часових точках оцінки ремісії у пацієнтів з В-лінійним гострим лімфобластним лейкозом, при урахуванні параметрів світлорозсіювання CD19/SSC враховують також інтенсивність флюоресценції + маркера CD34 на CD19 -лімфобластах. Спосіб виконується таким чином: матеріалом для дослідження являється кістковий мозок. Вид пробопідготовки - за протоколом фарбування - лізис-відмивка: кістковий мозок (по 100 мкл) інкубують протягом 30 хвилин (при кімнатній температурі в темряві) з антитілами до CD45, CD 19, CD34 (Becton Dickinson), міченими флюорохромом. Потім в пробірку вносять 2 мл лізируючого розчину (FACS lysing solution Becton Dickinson BD), розведеного 1:10 дистильованою водою. Тривалість інкубації триває 10 хвилин (при кімнатній температурі в темряві). Відмивку здійснюють методом центрифугування при 500 g/хв (5 хв) в розчині FACS Flow (BD). Після видалення надосадової рідини знову вносять 1 мл FACS Flow, після чого зразок аналізують на проточному цитометрі FACSCalibur (Becton Dickinson), який щоденно калібрують набором стандартних мікрочасток. Аналіз проводять за допомогою програмного забезпечення FACSComp (BD) - програма CellQUEST. Підрахунок - на 1 млн. клітин. Для аналізу спочатку виділяють популяцію В-клітин за параметрами світлорозсіювання CD19/SSC і вже у виділеному регіоні аналізують показники середньої інтенсивності флюоресценції (СІФ в ум.од.), антигену CD34. На двомірних гістограмах (FSC/SSC), де вісь X відображає розміри клітин, а вісь Υ гранулярність, положення клітин визначають в залежності від їх фізичних параметрів. Пухлинні (розмір від 12 до 15 μm) клітини знаходяться всередині популяції клітин-попередників різного ступеня зрілості та лінійної спрямованості. Це клітини доволі невеликого розміру (розмір від 10 до 20 μm), з низьким ступенем гранулярності і, відповідно, з низькими значеннями як за віссю X, так і за віссю Υ. Таким чином, за параметрами світлорозсіювання неможливо відмежувати бластні клітини від гематогенів. На підставі факту, що всі В-клітини будь-якого ступеня зрілості є позитивними за антигеном CD 19 (і нормальні В-попередники і пухлинні В-лімфобласти), + спочатку виділяють популяцію СО19 -клітин за параметрами світлорозсіювання CD19/SSC, виключаючи з дослідження попередники Т-лімфоїдної та мієлоїдної спрямованості, залишаючи + в аналізі тільки В-клітини. В пулі CD19 клітин враховують параметри експресії CD34 на всіх клітинах. На підставі того, що пухлинні клітини мають більш низький рівень інтенсивності флюоресценції антигену CD34, методом зворотного гейтирування виділяють популяцію з високими (В-попередники) та низькими (залишкові бласти) показниками СІФ CD34: на одномірних гістограмах, що реєструють інтенсивність флюоресценції, ці дві популяції мають 1 UA 81406 U 5 10 15 різне положення. В популяції з низькими значеннями СІФ CD34 підраховують кількість залишкових В-лімфобластів стандартним методом. Таким чином, показник інтенсивності флюоресценції СІФ є більш чітким критерієм визначення положення злоякісно трансформованих клітин, ніж показники світлорозсіювання. При імунофенотипуванні зразків кісткового мозку під час антилейкемічної терапії у пацієнтів з Влінійним гострим лімфобластним лейкозом показник СІФ маркера CD34 допомагає зареєструвати залишкові пухлинні В-лімфобласти і таким чином уникнути помилкових висновків при оцінці ремісії. З використанням запропонованого способу досліджено 24 пацієнти з гострим Влімфобластним лейкозом, на 15-й та 33-й дні терапії під час лікування у відділенні онкогематології для дітей з січня 2011 по листопад 2012 року. Джерела інформації: 1. Coustan-Smith Ε., Ribeiro R.C., Stow P., et al. A simplified flow cytometric assay identifies children with acute lymphoblastic leukemia who have a superior clinical outcome. Blood, 2006. - № 108(1). - Р. 97-102. 2. Майкл. Р. Локен, Денис А. Уэллс, Определение клеток-предшественников //Иммунология гемопоэза, 2010. - № 1. - С. 8-23. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Спосіб виділення залишкових В-лімфобластів серед елементів гемопоезу, який відновлюється, що заснований на урахуванні параметрів світлорозсіювання (FSC/SSC), який відрізняється тим, що враховують показники інтенсивності флюоресценції загальнолейкоцитарного антигену CD34 в сполученні з параметрами бокового світлорозсіювання (CD19/SSC). 25 Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2