Спосіб ідентифікації збудника бруцельозу у суміші проб матеріалу, взятих від груп тварин

Спосіб ідентифікації збудника бруцельозу у суміші проб матеріалу, взятих від груп тварин, в якому вносять до планшета підготовлені негативний контроль та позитивний контроль сироватки крові худоби на бруцельоз, шкубують м, промивають планшет і вносять до нього кон югат та шкубують, після інкубації планшет промивають і вносять туди розчин проявника та шкубують, зупиняють кольорову реакцію стоп-реагеном і визначають оптичну густину в лунках у двохвильовому режимі, який відрізняється тим, що підготовляють негативний контроль та позитивний контроль з суміші сироваток крові групи тварин, як кон'югат використовують імунопероксидазний кон'югат на основі моноклональних антитіл, а як проявник використовують хромоген - ортофенілендіамш або хромоген - тетраметилбензидин, а промивають фосфатно-сольовим розчином (рН 7,4) в суміші з 0,05 % розчином Твин - 20 Винахід відноситься до ветеринарної медицини, а саме до імуноферментного аналізу для виявлення шфікованості груп тварин збудниками бруцельозу, Лабораторне підтвердження бруцельозу істотно обмежено тим, що бруцелли відносяться до небезпечних збудників, виділення яких може проводитися тільки в спеціальних лабораторіях, підготовлені негативний контроль та позитивний контроль сироватки крові худоби на бруцельоз Інкубують її, промивають планшет і вносять до нього кон'югат та інкубують, після інкубації планшет промивають і вносять туди розчин проявника та інкубують, зупиняють кольорову реакцію стоп-реагеном і визначають оптичну густину в лунках у двохвильовому режимі, Недоліком цього способу для ветеринарної медицини є те, що в ній використовується сироватка тільки однієї тварини В основу винаходу поставлена задача розробити спосіб шдефікацм збудника бруцельозу у суміші проб матеріалу взятої від групи тварин в пули шляхом застосуванням нового набору реагентів та вибору режимів їх використання, що дозволяло би підвищити економічні показники при використанні способу при обробці великої КІЛЬКОСТІ тварин ВІДПОВІДНО ДО винаходу, підготовлюють негативний контроль та позитивний контроль з суміші сироваток крові групи тварин, як кон'югат використовують імунопероксідазний кон'югат на основі моноклональних антитіл, а як проявник використовують хромоген -ортофенілендіамш або хромоген -тетраметилбензидин, а промивають фосфатно-сольовим розчино (рН7,4) в суміші з 0,05% розчином Твин - 20 Підготовка зразків сироваток крові для дослідження в пулах Зразки обладнаних ВІДПОВІДНО ДО ВИМОГ профілактики При серологических і алергологічних дослідженнях потрібно враховувати, що у щеплених проти бруцельозу (щепляться групи ризику, професіонально контактуючі з тваринами) можуть бути і досить тривалий час позитивні результати як серолопчнихических реакцій, так і особливо алергічних проб Відомий спосіб виявлення проти бруцельозних антитіл у сироватках крові великої рогатої худоби в якому використовується тест-система імуноферментна для діагностики проти бруцельозних антитіл у сироватках крові великої рогатої худоби (ВРХ) В складі якої як кон'югативи використовують антивідові антитіла анти IgM + IgG ВРХ, мічені ферментом та включає імуносорбент з внесеними антигенами очищених культур штамів Bmceha abortus 1119 (1), Поставлена задача вирішується у способі шдентифікацм збудника бруцельозу у суміші проб матеріалу взятих від груп тварин, в якому вносять до планшету 00 со ^00 ю 58438 10 сироваток, що підготовлені для аналізу, змішують в однакових пропорціях (по 0,1см3) в окремій пробірці Ретельно перемішують та використовують для аналізу Пули сироваток зберіганню не підлягають Приклад виконання способу на стриптовому планшеті Готують розчин для промивання 12-5см3, Вміст флакона концентрату розчина №1 Інтенсивно струшують і розводять у 350см очищеної води та перемішують Якщо концентрат розчину кристалізований, його нагрівають перед застосуванням при 35-37°С до повного розчинення кристалів Розчин можна зберігати при температурі від 2 до 8°С не довше 5 діб, Виймають імуносорбент з пакувального пакету та вносять в усі лунки по 0,35см3 цього розчину, витримують стрипи залитими 30-40 секунд і видаляють розчин з лунок за допомогою промивача або 8-канальноі піпетки, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу В кожну лунку вносять по 0,095см3 розчину для розведення сироваток для розведення сироваток В лунки планшету вносять по 0,005см3 зразків досліджуваних сироваток, залишивши вільними 5 лунок першого ряду (лунки для контролів) В дві лунки (А1, В1) вносять по 0,005см3 позитивного контролю (К+), а в три ІНШІ (01-Е1) по 0,005см3 негативного контролю (К-) Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та шкубують при і температурі 37°С 60 хвилин По закінченні інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальноі піпетки та промивають лунки чотири рази розчином №1, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу Приготування розчину кон'югату В ампулу з кон'югатом вносять 0,3-0,4мл розчину для розведення кон'югату Після повного розчинення вміст ампули переносять у флакон з розчином № 4 Вміст флакона ретельно перемішують, не допускаючи ціноутворення Цю процедуру повторюють тричі з метою повного вилучення кон'югату з ампули Розчин кон'юганту готують безпосередньо перед використанням Приготування розчину проявника В чистий флакон пінцетом вносять таблетку або хромогену ортофенілендіамш (ОФД) і додають 9см очищеної води, інтенсивно струшують і залишають флакон у темному МІСЦІ до повного розчинення хромогену або використовують розчин хромогену тетраметилбензидин (ТМБ) Безпосередньо перед внесенням у лунки стрипів у флакон з розчином для приготування проявника (розчин №5) додають розчин хромогену, суміш інтенсивно струшують Розчин готують безпосередньо перед використанням В лунки стрипів вносять по 0,1см3 розчину кон'югату Накривають планшет клейкою плівкою Комп'ютерна верстка О В Кураєв або кришкою та шкубують при 37°С у термостаті ЗО хвилин По закінченні інкубації видаляють розчин кон'югату з лунок за допомогою промивача або 8канальної піпетки та промивають лунки шість разів розчином, що є фосфатно-сольовим розчином (рН7,4) в суміші з 0,05% розчином Твин - 20 за Aldnch кат №27,432-8 Після ЧОГО позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу, Вносять в лунки стрипів по 0,1см3 розчину проявника Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та шкубують при 18-22°С в темному МІСЦІ до ЗО хвилин Зупиняють кольорову реакцію внесенням до всіх лунок по 0,05см3 розчину стоп-реагенту Не більше як через 1 хвилину після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у даохвильовому режимі (492нм відносно 620нм) Облік результатів аналізу Розраховують середнє значення оптичної густини (ОГ) для лунок негативного контролю (ОГ К-) і для позитивного контролю (ОГ К+) Проведення аналізу вважають коректним, якщо ОГ К- не вище 0,1 оптичної одиниці (00), а ОГ К + не нижче 0,6 00 Якщо одне з трьох значень ОГ К- більше 0,1 00 або більше ніж в два рази перевищує ОГ К-, його відкидають та ОГ К- розраховують за рештою значень ОГ КГраничне значення ОГ (ГЗ) ГЗ розраховують, додаючи константну для кожної серії наборів величину до значення ОГ К"Сіра зона" - зона значень ОГ, яка простягається від ГЗ до значень менших ГЗ на 10% Результати аналізу вважаються негативними, якщо значення ОГ досліджуваного зразка менше рівня ОГ "сірої зони" Результати аналізу вважаються позитивними, якщо значення ОГ досліджуваного зразка більше ГЗ Зразки, які мають значення ОГ в межах "сірої зони", вважаються невизначеними Зразки, що, дали позитивний або невизначений результат, необхідно досліджувати повторно не менш як у двох лунках системи Зразки, позитивні в одній або більше лунках, слід вважати позитивними Зразки, негативні в двох або більше лунках, слід вважати негативними В разі отримання позитивного або невизначеного результату у випадку дослідження пулів сироваток необхідно переставити кожний зразок сироватки окремо в розрахунку один зразок - одна лунка Для автоматичного обліку результатів аналізу застосовують обчислювальну програму, 1 Джерело інформації патент України №48811 А, публ 15 08 02, бюл №8 Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна