Набір засобів для діагностування лейкозу тварин

Набір засобів для діагностування лейкозу тварин, який характеризується тим, що має першу, другу, третю та четверту комплектації, до кожної з них входять: імуносорбент; кон'югат імуноферментний; концентрат розчину для промивання планшету; розчин (стоп-реагент); розчин для розведення сироваток; розчин для приготування проявника; позитивний контроль (К+); негативний контроль (К-); клейка плівка, при цьому в першій комплектації додатково використовують суцільний планшет, а як хромоген додатково використовують ортофенілендіамін, у другій комплектації додатково використовують суцільний планшет, а як хромоген додатково використовують 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, у третій комплектації додатково використовують стриповий планшет, а як хромоген додатково використовують ортофенілендіамін, у четвертій комплектації додатково використовують стриповий планшет, а як хромоген додатково використовують 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Корисна модель відноситься до ветеринарної медицини, а саме до ідентифікації в біологічних речовинах тварин протилейкозних антитіл. Заявнику невідомо з рівня техніки найближчого аналогічного рішення стосовно діагностичного набору. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити набір засобів для діагностування лейкозу тварин шляхом використання компонентів, які забезпечують проведення імуноферментного аналізу біологічної речовини забезпечити швидкий і якісний процес діагностування захворювання на лейкоз у тварин. Поставлена задача вирішується у діагностичному наборі засобів для діагностування лейкозу тварин, відповідно до технічного рішення, що заявляється, у корисній моделі, має першу, другу, третю та четверту комплектації, до кожного з них входять: імуносорбент; кон'югат імуноферментний; концентрат розчину для промивання планшету; розчин (стоп-реагент); розчин для розведення сироваток; розчин для приготування проявника; позитивний контроль (К+); негативний контроль (К-); клейка плівка, при цьому в першій комплектації додатково використовують суцільний планшет, а як хромоген додатково використовують ортофенілендіамін, у другій комплектації додатково використовують суцільний планшет, а як хромоген додатково використовують 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, у третій комплектації додатково використовують стриповий планшет, а як хромоген додатково використовують ортофенілендіамін, у четвертій комплектації додатково використовують стриповий планшет, а як хромоген додатково використовують 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. До складу набору входять слідуючи реагенти. Імунопероксидазний кон'югат (кон'югат) світло-солом'яна опалесцентна рідина являє собою: - модифіковані моноклональні антитіла до імуноглобулінів класу G великої рогатої худоби, пероксидаза хрону, Позитивний контроль (1С) - світло-солом'яна трохи опалесцуюча рідина являє собою сироватку крові ВРХ проімунізованих лейкозним антигеном, що позитивно реагує у ІФА. Негативний контроль (К~) - світло-солом'яна трохи опалесцуюча рідина, сироватка крові ВХР, що не містить антитіл до вірусу лейкозу; Хромоген - ортофенілендіамін (ОФД) таблетка білого з сіруватим відтінком кольору, оГ Хромоген - тетраметилбензидин (ТМБ) - прозора безбарвна рідина, З^'Дб'-тетраметилбензидин; Розчини: - розчин для промивання (розчин №1) безбарвна опалесцуюча рідина, допускається розшарування та випадіння кристалічного осаду, що розчинюється при температурі (35-37)°С протягом 15-20 хвилин. - стоп-реагент (розчин №2) - прозора, безбарвна рідина. - розчин для розведення сироваток (розчин №3) - фіолетова трохи опалесцуюча рідина. - розчин для приготування проявника (розчин №5) - прозора безбарвна рідина. До складу розчинів входять: натрій фосфорнокислий двозаміщений дванадцятиводний згідно з ГОСТ 4172; натрій фосфорнокислий однозаміщений двоводний згідно з ГОСТ 245; - натрій хлористий згідно з ГОСТ 4233; - сечовина згідно з ГОСТ 6691; - тритон Х-100 імпортований, фірми Aldrich, кат, №23, 472-9; - твін-20 імпортований, фірми Aldrich, кат. №27, 434-8; - мертіолат імпортований, фірми "Serva" кат. №11340; - білок G імпортований, фірми "ICN" кат. №672651; - білок G-HrP імпортований, фірми "ICN" кат. №672681; - протеїн G, рекомбінантний імпортований, фірми "Fluka" кат. №82509; - альбумін бичачий імпортований, фірми "Sigma" кат. №А7030; - альбумін конячий імпортований, фірми "Sigma" кат. №А9888; - альбумін вівці імпортований, фірми "Sigma" кат. №А2514; пероксидази стабілізуючий буфер імпортований, фірми "Sigma" кат. №Р9209; - протеїназа К імпортована, фірми "Sigma" кат. №Р2308; - агароза імпортована, фірми "Sigma" кат. №А9414; - Ni-CAM HC целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. №N3158; - DEAE-650S целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. №8-07472 - SP-650S целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. №8-08437; - СМ-650С целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. №8-07475; - бензойна кислота згідно з ГОСТ 10521; - бромкрезоловий пурпурний за діючою нормативною документацією; - фенолфталеїновий червоний за діючою нормативною документацією; - сухе знежирене молоко згідно з ГОСТ 10970; - лимонна кислота згідно з ГОСТ 3652; - гідроперит згідно з ФС 42-2140; - кислота сірчана згідно з ГОСТ 4204; - вода очищена згідно з ФС 42-2619. Імуносорбент - очищені антигени вірусу лейкозу, отримані в лабораторних умовах згідно з вимогами технологічних інструкцій, який 10115 4 сорбовано на поверхні лунок полістиродових планшетів. Таблетки ОФД розчинюють у 9см 3 очищеної води при 20±2°С при струшуванні протягом 5-10 хвилин. Концентрація водневих іонів (рН) розчинів №1, №3 - 7,3±0,1, а №5 - 5,3±0,1 (при розчиненні 12см 3 розчину у 350мл очищеної води). Використовується тест - система наступним чином. Приготування розчину для промивання планшета (розчин №1). Вміст флакона концентрату розчину №1 інтенсивно струшують і розводять у 435см 3 очищеної води та перемішують. Якщо концентрат розчину кристалізований, його нагрівають перед застосуванням при (35-37)° С до повного розчинення кристалів. Розчин можна зберігати при температурі (2-8)° С не довше 5 діб. Приготування розчину кон'югату. В окремий флакон вносять 12см приготованого згідно розчину №1. В ампулу з кон'югатом вносять(0,3-0,4)см розчину №1. Після повного розчинення вміст ампули переносять у флакон. Вміст флакона ретельно перемішують піпетуванням, не допускаючи піноутворення. Цю процедуру повторюють тричі з метою повного вилучення кон'югату з ампули. Розчин кон'югату готують безпосередньо перед використанням. Приготування розчину проявника. В чистий флакон вносять таблетку хромогена ОФД і додають 9см очищеної води, інтенсивно струшують і залишають флакон у темному місці до повного розчинення хромогену. Безпосередньо перед внесенням у лунки стрипів у флакон з розчином №5 додають розчин хромогену, суміш інтенсивно струшують. Розчин готують безпосередньо перед використанням. Розчин проявника необхідно оберігати від попадання світла та контакту з металами або іонами металів. Перед використанням розчин проявника повинен бути безбарвним. Підготовка зразків до випробування. Підготовка зразків сироваток крові тварин. Зразки сироваток, які містять осад необхідно освітлювати центрифугуванням. Зразки сироваток зберігають (2-6)°С протягом трьох діб; якщо немає можливості провести аналіз в даний термін, зразки необхідно заморозити. Процес заморожування та відтавання повинен бути не більше 2 разів. Зразки з гемолізом та бактеріальним проростом для аналізу не придатні. Підготовка зразків сироваток крові для дослідження в пулах. Зразки 10 сироваток, що підготовлені для аналізу, змішують в однакових пропорціях (по 0,1см3) в окремій пробірці. Ретельно перемішують та використовують для аналізу. Пули сироваток зберіганню не підлягають. Підготовка зразків сироваток молока ВРХ. Свіжовідібране молоко піддають центрифугуванню при 1500об/хв. протягом 10 хвилин для отримання молочної сироватки. Центрифужні стаканчики залишають при (4±2)°С протягом ЗО хвилин, після чого проводять відбір молочної сироватки з під шару сливок. Зразки молочної сироватки довгостроково зберігають в замороженому стані. Процес заморожування та відтавання зразків сироватки повинен бути не більше 2 разів. Проведення випробування. Готують розчин №1. Виймають імуносорбент з пакувального пакету та вносять в усі лунки по 0,35см3 розчину №1, витримують залитим 30-40 секунді видаляють розчин з лунок за допомогою промивача або 8канальної піпетки, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу. В колену лунку вносять по 0,09см3 розчину №3 для розведення сироваток. В лунки планшету вносять по 0,01см3 зразків досліджуваних сироваток, залишивши вільними 5 лунок першого ряду (лунки для контролів). В дві лунки (А1, В1) вносять по 0,01см3 позитивного контролю (К+), а в три інші (D1-E1) - по 0,01см негативного контролю (К-). При внесенні контрольних та досліджуваних зразків необхідно обережно піпетувати суміш. Під час піпетування відбувається зміна кольору розчину в лунках. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37°С 60 хвилин. По закінченні інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки та промивають лунки чотири рази розчином №1, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу. Готують розчин кон'югату. В лунки імуносорбенту вносять по 0,1см розчину кон'югату. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при 37°С у термостаті 20 хвилин. По закінченні інкубації видаляють розчин кон'югату з лунок за допомогою промивача або 8канальної піпетки та промивають лунки шість разів розчином №1, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу. Проведення випробування з використанням хромогену ОФД. Готують розчин проявника. Вносять в лунки стрипів по 0,1см3 розчину проявника. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при (18-22)°С в темному місці до ЗО хвилин. Зупиняють кольорову реакцію внесенням до всіх лунок по 0,05см3 розчину №2 (стоп-реагенту). Комп'ютерна верстка А. Крижанівський 10115 Не більше як через 1 хвилину після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (492нм відносно 620нм). Як виняток, ОГ можна визначати в однохвильовому режимі (492нм) відносно порожньої лунки (бланк). Необхідно передбачити порожню лунку при аналізі. При роботі в однохвильовому режимі знижується чутливість та точність аналізу. Проведення випробування з використання хромогену ТМБ. Вносять в лунки планшету по 0,1см розчину хромогену ТМБ. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при (18-22)°С в темному місці протягом 20 хвилин. Зупиняють кольорову реакцію внесенням до всіх лунок по 0,05см3 розчину №2 (стоп-реагенту). Не більше як через 1 хвилину після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках в однохвильовому режимі (450нм). Облік результатів аналізу. Розраховують середнє значення оптичної густини (ОГ) для лунок негативного контролю (ОГ К-) і для позитивного контролю (ОГ К+). Проведення аналізу вважають коректним, якщо ОГ К- не вище 0,2 оптичної одиниці (ОО), а ОГ К+ не нижче 0,6 ОО. Якщо одне з трьох значень ОГ К- більше 0,2 ОО його відкидають та ОГ К- розраховують за рештою значень ОГ К-. Граничне значення ОГ (ГЗ). ГЗ розраховують, додаючи константну для кожної серії наборів величину до значення ОГ К-. Значення константної величини встановлює для кожної серії тест-систем виробник, і вказує його в настанові по використанню тест-системи. "Сіра зона" - зона значень ОГ, яка простягається від ГЗ до значень менших ГЗ на 10%. Результати аналізу вважаються негативними, якщо значення ОГ досліджуваного зразка менше рівня ОГ "сірої зони". Результати аналізу вважаються позитивними, якщо значення ОГ досліджуваного зразка більше ГЗ. Для автоматичного обліку результатів аналізу застосовують обчислювальну програму. Порядок програмування автоматичного спектрофотометра (ридера) та користування програмою додається по вимозі користувача. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. К и ї в - 4 2 , 01601