Спосіб ідентифікації антитіл до лейкозу тварин у суміші проб біологічного матеріалу від груп тварин

Спосіб ідентифікації антитіл до лейкозу тварин у суміші проб біологічного матеріалу від груп тварин, що включає використання набору діагностичних компонентів, який відрізняється тим, що вносять до планшета підготовлені негативний контроль та позитивний контроль з суміші біологічної рідини групи тварин, інкубують її, промивають планшет і вносять до нього кон'югант та інкубують, після інкубації планшет промивають і вносять туди розчин проявника та інкубують, зупиняють реакцію стоп-реагеном і визначають оптичну густину в лунках у двохвильовому режимі, при цьому як кон'югант використовують імунопероксидазний кон'югант на основі моноклональних антитіл, а як проявник використовують хромоген - ортофенілендіамін або хромоген - тетраметилбензидин. Корисна модель відноситься до ветеринарної медицини, а саме до імуноферментного аналізу для виявлення інфікованості тварин лейкозом і призначена для виявлення в сироватках крові та молоці великої рогатої худоби (ВРХ) протилейкозних антитіл. Відомий спосіб виявлення специфічних антитіл до вірусу лейкозу ВРХ методом імуноферментного аналізу, що включає використання набору діагностичних компонентів, при цьому використовують вірус, одержаний шляхом одночасного культивування ембріональних клітин нирки вівці з клітинами лімфовузла великої рогатої худоби, очищений і концентрований методом адсорбційної та молекулярно-ситової хроматографії на макропористих сорбентах, облік результатів автоматизований (UA 55284A). Недоліком цієї тест-системи для ветеринарної медицини є те, що в ній можливо тестувати сироватку крові тільки великої рогатої худоби. В основу корисної моделі поставлена задача розробити тест-систему для специфічної імуноферментної діагностики проти лейкозних антитіл у біологічних рідинах від тварин "ІФА-ЛЕЙКО АВ" шляхом виявлення антитіл при цьому застосовуючи набір реагентів, що дозволяє підвищити універсальність використання процесу виявлення антитіла та підвищити його чутливість. Поставлене завдання в корисній моделі тестсистеми діагностичної лейкозу тварин імуноферментної "ІФА-ЛЕЙКО АВ" вирішується завдяки то му, що включає планшет, набір реагентів для імуноферментного аналізу та проявник, відповідно до корисної моделі, має імунопероксидазний кон'югат на основі моноклональних антитіл, розчин для розведення біологічних компонентів та розчин для промивання. Як проявник використовується хромоген ортофенілендіамін. Як проявник використовується хромоген тетраметилбензидин. Як універсальний розчин включає в себе фракцію молока корів, фракцію сироватки крові корів, сечовину (0,5-2,5%) та розчин Тритон Х-100(0,05-1,5%). Як розчин для промивання використовується фосфатно-сольовий буфер з 0,05% Твин-20. Як планшет використовується суцільний або стриповий планшет. Завдяки використанню імунопероксидазного кон'югату на основі моноклональних антитіл, універсального розчину для розведення біологічних компонентів та розчинів для промивання, а також оригінальній підготовці імуносорбенту тестсистема дозволяє без зміни комплектації проводити діагностику лейкозу різних видів тварин, використовуючи різні біологічні проби від цих тварин. До складу тест-системи входять слідуючи реагенти. Імунопероксидазний кон'югат (кон'югат) - світло-солом'яна опалесцентна рідина являє собою: - модифіковані моноклональні антитіла до імуноглобулінів класу G великої рогатої худоби, пероксидаза хрону; Позитивний контроль (К*) - світло-солом'яна О) 10147 трохи опалесцуюча рідина являє собою сироватку крові ВРХ проімунізованих лейкозним антигеном, що позитивно реагує у ІФА. Негативний контроль (К") - світло-солом'яна трохи опалесцуюча рідина сироватка крові ВХР, що не містить антитіл до вірусу лейкозу; Хромоген - ортофенілендіамін (ОФД) - таблетка білого з сіруватим відтінком кольору. Хромоген тетраметилбензидин (ТМБ) - прозора безбарвна рідина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин; Розчини: - розчин для промивання (розчин №1) - безбарвна опалесцуюча рідина, допускається розшарування та випадіння кристалічного осаду, що розчинюється при температурі (35-37)°С протягом 1520 хвилин. - стоп-реагент (розчин №2) - прозора, безбарвна рідина. - розчин для розведення сироваток (розчин №3) - фіолетова трохи опалесцуюча рідина. - розчин для приготування проявника (розчин №5) - прозора безбарвна рідина. До складу розчинів входять: - натрій фосфорнокислий двозаміщений дванадцятиводний згідно з ГОСТ 4172; - натрій фосфорнокислий однозаміщений двоводний згідно з ГОСТ 245; - натрій хлористий згідно з ГОСТ 4233; - сечовина згідно з ГОСТ 6691; - тритон Х-100 імпортований, фірми Aldrich, кат. №23, 472-9; - твін-20 імпортований, фірми Aldrich, кат. №27, 434-8; - мертіолат імпортований, фірми "Serva" кат. №11340; - білок G імпортований, фірми "ICN" кат. №672651; - білок G-HrP імпортований, фірми "ICN" кат. №672681; - протеїн G, рекомбінантний імпортований, фірми "Fluka" кат. №82509; - альбумін бичачий імпортований, фірми "Sigma" кат. №А7030; - альбумін конячий імпортований, фірми "Sigma" кат. №А9888; - альбумін вівці імпортований, фірми "Sigma" кат. №А2514; пероксидази стабілізуючий буфер імпортований, фірми "Sigma" кат. №Р9209; - протеїназа К імпортована, фірми "Sigma" кат. №Р2308; - агароза імпортована, фірми "Sigma" кат. №А9414; - Ni-CAM HC целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. №N3158; - DEAE-650S целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. №8-07472; - SP-650S целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. №8-08437; - СМ-650С целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. №8-07475; - бензойна кислота згідно з ГОСТ 10521; - бромкрезоловий пурпурний за діючою нормативною документацією; - фенолфталеїновий червоний за діючою нормативною документацією; - сухе знежирене молоко згідно з ГОСТ 10970; - лимонна кислота згідно з ГОСТ 3652; - гідроперит згідно з ФС 42-2140; - кислота сірчана згідно з ГОСТ 4204; - вода очищена згідно ФС 42-2619. Імуносорбент - очищені антигени вірусу лейкозу, отримані в лабораторних умовах згідно з вимогами технологічних інструкцій, який сорбовано на поверхні лунок полістиродових планшетів. Таблетки ОФД розчинюють у 9см 3 очищеної води при 20±2°С при струшуванні протягом 5-10 хвилин. Концентрація водневих іонів (рН) розчинів №1, №3 - 7,3±0,1, а №5 - 5,3±0,1 (при розчиненні 12см3 розчину у 350мл очищеної води). Номінальний об'єм розчинів: кон'югат від 0,1 до 0,2см3; позитивний контроль від 0,1 до 0,2см3; негативний контроль від 0,1 до 0,2см3. розчин №1 - 12см3; розчин №2 стоп-реагент - 12см3; розчин №3 - 12см3; розчин №5 - Зсм 3 ; хромоген ТМБ - 12см3. Використовується тест - система наступним чином. Приготування розчину для промивання планшета (розчин №1) Вміст флакона концентрату розчина №1 інтенсивно струшують і розводять у 435см 3 очищеної води та перемішують. Якщо концентрат розчину кристалізований, його нагрівають перед застосуванням при (35-37)°С до повного розчинення кристалів. Розчин можна зберігати при температурі (2-8)°С не довше 5 діб. Приготування розчину кон'югату. В окремий флакон вносять 12см3 розчину №5. В ампулу з кон'югатом вносять(0,3-0,4)см3 розчину №5. Після повного розчинення вміст ампули переносять у флакон. Вміст флакона ретельно перемішують піпетуванням, не допускаючи піноутворення. Цю процедуру повторюють тричі з метою повного вилучення кон'югату з ампули. Розчин кон'югату готують безпосередньо перед використанням. Приготування розчину проявника. В чистий флакон вносять таблетку хромогена ОФД і додають 9см 3 очищеної води, інтенсивно струшують і залишають флакон у темному місці до повного розчинення хромогену. Безпосередньо перед внесенням у лунки стрипів у флакон з розчином №5 додають розчин хромогену, суміш інтенсивно струшують. Розчин готують безпосередньо перед використанням. Розчин проявника необхідно оберігати від попадання світла та контакту з металами або іонами металів. Перед використанням розчин проявника повинен бути безбарвним. Підготовка зразків до випробування. Підготовка зразків сироваток крові тварин. Зразки сироваток, які містять осад необхідно освітлювати центрифугуванням. Зразки сироваток зберігають (2-6)°С протягом трьох діб; якщо немає можливості провести аналіз в даний термін, зразки необхідно заморозити. Процес заморожування та відтавання повинен бути не більше 2 разів. Зразки з гемолізом та бактеріальним проростом для 10147 місці до ЗО хвилин. аналізу не придатні. Зупиняють кольорову реакцію внесенням до Підготовка зразків сироваток крові для всіх лунок по 0,05см" розчину №2 (стоп-реагенту). дослідження в пулах. Не більше як через 1 хвилину після зупинення Зразки 10 сироваток, що підготовлені для кольорової реакції визначають оптичну густину аналізу, змішують в однакових пропорціях (по (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (492нм 0,1см ) в окремій пробірці. Ретельно перемішують відносно 620нм). та використовують для аналізу. Пули сироваток Як виняток, ОГ можна визначати в однохвильзберіганню не підлягають. овому режимі (492нм) відносно порожньої лунки Підготовка зразків сироваток молока ВРХ. (бланк). Необхідно передбачити порожню лунку Свіжовідібране молоко піддають центрифугупри аналізі. При роботі в однохвильовому режимі ванню при 1500об/хв. протягом 10 хвилин для отзнижується чутливість та точність аналізу. римання молочної сироватки. Центрифужні стаканчики залишають при (4±2)°С протягом ЗО Проведення випробування з використання хвилин, після чого проводять відбір молочної сихромогену ТМБ. роватки з під шару сливок. Зразки молочної сироВносять в лунки планшету по 0,1см3 розчину ватки довгостроково зберігають в замороженому хромогену ТМБ. Накривають планшет клейкою стані. Процес заморожування та відтавання плівкою або кришкою та інкубують при (18-22)°С в зразків сироватки повинен бути не більше 2 разів. темному місці протягом 20 хвилин. Проведення випробування Зупиняють кольорову реакцію внесенням до всіх лунок по 0,05см3 розчину №2 (стоп-реагенту). Готують розчин №1. Не більше як через 1 хвилину після зупинення Виймають імуносорбент з пакувального пакету кольорової реакції визначають оптичну густину та вносять в усі лунки по 0,35см3 розчину №1, ви(ОГ) в лунках в однохвильовому режимі (450нм). тримують залитим 30-40 секунд і видаляють розчин з лунок за допомогою промивача або 8Облік результатів аналізу канальної піпетки, після чого позбавляються зайРозраховують середнє значення оптичної гусвої вологи, постукуючи планшетом по фільтруватини (ОГ) для лунок негативного контролю (ОГ К-) і льному паперу. В кожну лунку вносять по 0,09см3 для позитивного контролю (ОГ К+). Проведення розчину №3 для розведення сироваток. В лунки аналізу вважають коректним, якщо ОГ К- не вище планшету вносять по 0,01см3 зразків 0,2 оптичної одиниці (ОО), а ОГ К+ не нижче 0,6 досліджуваних сироваток, залишивши вільними 5 ОО. лунок першого ряду (лунки для контролів). В дві Якщо одне з трьох значень ОГ К- більше 0,2 лунки (А1, В1) вносять по 0,01см3 позитивного конОО його відкидають та ОГ К- розраховують за тролю (К+), а в три інші (D1-E1) - по 0,01см3 негарештою значень ОГ К-. Граничне значення ОГ тивного контролю (К-). При внесенні контрольних (ГЗ). ГЗ розраховують, додаючи константну для та досліджуваних зразків необхідно обережно кожної серії наборів величину до значення ОГ К-. піпетувати суміш. Під час піпетування відбуваєтЗначення константної величини встановлює ься зміна кольору розчину в лунках. Накривають для кожної серії тест-систем виробник, і вказує планшет клейкою плівкою або кришкою та інкуйого в настанові по використанню тест-системи. бують при температурі 37°С 60 хвилин. По за"Сіра зона" - зона значень ОГ, яка простягається кінченні інкубації видаляють вміст лунок за доповід ГЗ до значень менших ГЗ на 10%. Результати могою промивача або 8-канальної піпетки та аналізу вважаються негативними, якщо значення промивають лунки чотири рази розчином №1, ОГ досліджуваного зразка менше рівня ОГ "сірої після чого позбавляються зайвої вологи, постузони". куючи планшетом по фільтрувальному паперу. Результати аналізу вважаються позитивними, якщо значення ОГ досліджуваного зразка більше Готують розчин кон'югату. ГЗ. В лунки імуносорбенту вносять по 0,1см3 розчину кон'югату. Накривають планшет клейкою Для автоматичного обліку результатів аналізу плівкою або кришкою та інкубують при З 7°С у застосовують обчислювальну програму. Порядок термостаті 20 хвилин. програмування автоматичного спектрофотометра (ридера) та користування програмою додається по По закінченні інкубації видаляють розчин кон'вимозі користувача. югату з лунок за допомогою промивача або 8канальної піпетки та промивають лунки шість разів В залежності від комплектації тест-система розчином №1, після чого позбавляються зайвої може випускатись в чотирьох варіантах: вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальноВаріант №1а - суцільний планшет, хромоген му паперу. ОФД. Варіант №16 - суцільний планшет, хромоген Проведення випробування з використанням ТМБ. хромогену ОФД. Варіант №2а - стриповий планшет, хромоген Готують розчин проявника. ОФД. Вносять в лунки стрипів по 0,1см3 розчину проявника. Накривають планшет клейкою плівкою Варіант №26 - стриповий планшет, хромоген або кришкою та інкубують при (18-22)°С в темному ТМБ. Комп'ютерна верстка Г. Паяльніков Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601