Спосіб визначення наслідування стійкості картоплі до раку synchytrium endobioticum (schilb) perc.

Спосіб визначення наслідування СТІЙКОСТІ картоплі до раку, що включає виділення білків і аналіз їх амінокислотного складу з контрастних за СТІЙКІСТЮ до раку сортів картоплі, який відрізняється тим, що у сприйнятливих до раку сортах сума незамінних амінокислот (лізин, треонін, метіонін, лейцин, ізолейцин, валін, фенілаланін, триптофан) більша на 2% Корисна модель відноситься до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від шкідливих організмів та хвороб В картоплярстві ВІДОМІ лабораторні та польові способи визначення ракостійкості картоплі, засновані на безпосередньому зараженні сортів та гібридів картоплі літними зооспорами від свіжих ракових наростів в лабораторних умовах [6], а також зимовими зооспорами в польових умовах [5] ВІДОМІ біохімічні способи визначення ракостійкості картоплі білковим екстрактом зі ракових наростів [7] та шляхом інфрачервоної спектроскопії [2] Також відомий спосіб визначення СТІЙКОСТІ картоплі до збудника раку шляхом гібридологічного аналізу селекційного матеріалу картоплі та його вихідних батьківських форм на реакцію до патогену (найближчий аналог) [4] Спосіб, що описаний в найближчому аналогу, полягає в тому, що він включає в себе оцінку СТІЙКОСТІ ВИХІДНИХ батьківських форм картоплі та їх потомства одержаного від їх схрещування (в відсотках) Після зараження зразків картоплі на 60 добу проводять аналіз ураження зразків картоплі і підраховують відсоток стійких (неуражених) та сприйнятливих (уражених) зразків Згадані способи та спосіб - найближчий аналог мають такі недоліки 1 Вони є трудомісткими Дослідження по визначенню СТІЙКОСТІ картоплі до раку пов'язані з використанням збудника хвороби 2 Ці способи є довготривалими їх використання пов'язане з затратою часу (від 21 до 60 діб) 3 Складові компоненти згаданих способів досить дефіцитні В основу корисної моделі поставлено завдання розробити більш досконалий метод визначення наслідування СТІЙКОСТІ картоплі до раку, який буде використаний селекційними установами для підбору ракостійких батьківських форм картоплі і отримання ракостійкого потомства Поставлені завдання досягаються тим, що у запропонованому способі шляхом здійснення ряду прийомів, а саме виділення амінокислот з вихідних батьківських форм картоплі, шляхом амінокислотного аналізу білків вдається отримати різні показники вмісту амінокислот без використання збудника раку В результаті цього отримана різна КІЛЬКІСТЬ незамінних та замінних амінокислот кислот у сприйнятливих та стійких сортів картоплі 1 Суттєвою ВІДМІННІСТЮ даного способу є те, що він реалізується без використання збудника раку картоплі, який є карантинним об'єктом 2 Запропонований спосіб займає набагато менше часу (3 доби) 3 Спосіб дозволяє за даним біохімічним тестом підібрати ракостійкий вихідний батьківський матеріал картоплі для схрещування і отримати ракостійке потомство ПРИКЛАД 1 Зразки бульб картоплі різних сортів заражають збудником раку в лабораторних умовах [6] Коли паростки бульб картоплі досягали 1-2мм, їх інфікували ЛІТНІМИ зооспорами з ракових ео О ю о> 10504 наростів. Для цього навколо паросткової частини бульби закріпляли вазеліном та парафіном (2:1) паперове кільце, в яке наливали дистильовану воду і клали відмиті ракові нарости розміром 3 0,5см , які містять літні зооспорангії з зооспорами збудника раку. Експозиція зараження 24 години при температурі 12-13°С. Після цього інфікований матеріал та кільце знімали з бульб, а заражені зразки картоплі залишали в темряві до 21 доби. На 21 добу, коли проявились симптоми захворювання, проводили облік уражених бульб під бінокулярною лупою і відзначали ступінь ураження патогеном. Результати приведені в таблиці 1, додаток 1. В аналізованих таким чином зразках картоплі виявлено один стійкий зразок та один зразок сприйнятливий до раку. В аналізованих таким чином зразках картоплі (Таблиця 1, додаток 1) виявлено, що сорт картоплі Темп стійкий до раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc, а сорт Вале - сприйнятливий до раку. ПРИКЛАД 2. Сумарні білки виділяли за методом Гааль Е., Медьєші Г. та Верецького Л. [1]. Наважку рослинного матеріалу (5г паростків картоплі) розтирали з 0,01 М трис-глициновим буфером з 0,1% ЕДТА і 0,5% аскорбіновою кислотою при 4°С (1:5). Гомогенат центрифугували протягом 15хв. при 12000об./хв. і використовували для виділення амінокислот. Амінокислотний склад білків сортів картоплі визначали за методом Плешкова Б.П. [3] на амінокислотному аналізаторі JLC-6 фірми JEOL (Японія). Гідроліз білків проводили з 6 н НСІ протягом 24 годин при 105°С у співвідношенні кислоти до білка 100:1 в запаяних ампулах. Хроматографію амінокислот проводили, використовуючи 0,2 Naцитратний буфер з рНЗ,25, 0,25 н Na-цитратний буфер з рН4,25 і 0,35 н Na-цитратний буфер з рН5,28. Фарбували нінгідриновим реактивом. В якості стандарту використовували стандартний амінокислот і отримали стандартну хромотограму [3]. Визначення триптофану проводили окремо, оскільки при кислотному гідролізі він руйнується. Зразки білків розчиняли в 0,2 н NaOH при слабкому нагріванні до 36°С, додавали 23,7 н H2SO4 та 0,03% парадиметила-мінобензоальдегід і зливали на 12 годин потім додавали 0,1 мл 0,045% розчину азиду натрію і після ЗО годин визначали оптичну щільність на спектрофотометрі СФ-26 при бООнм. Для контролю брали воду [3]. При визначені амінкислотного складу білків стійкого сорту картоплі Темп і сприйнятливого до раку сорту Вале виявити схожість їх білків (Таблиця 2, фігура, додаток 2) за кількістю двоосновних амінокислот (лізину, гістидину і аргініну). Кількість аліфатичних амінокислот (гліцину, аланіну) була майже однаковою у цих сортів картоплі. У складі даних білків відмічено присутність оксиамінокислот (треоніну і серину). Для цих сортів характерна велика кількість дикарбонових амінокислот: аспа рагінової і глютамінової, а також аргініну, їх кількість складає 9,0% і 10,4% у сорту Темп і 8,9% і 10,6% у сорту Вале. Із сірковмісних амінокислот у сорту Темп відмічено присутність метіоніну, цистеїну, в невеликій кількості цистіну. Аналізуючи склад незамінних амінокислот, які входять до складу білків картоплі, можна побачити значну різницю: їх сума у стійкого до ражу сорту картоплі Темп складає 40,4%, а у сприйнятливого до раку сорту Вале - 42,3%. Вона збільшена в основному за рахунок вмісту триптофану і незначно фенілаланіну, лейцину, ізолейцину, лізину, який вищий у сорту Вале, ніж у сорту Темп. Відомо, що картопля тим і ціниться, що вона містить всі 8 незамінних амінокислот. Ще відомо, що в основному вражаються раком картоплі й іншими шкідниками та хворобами сорти, які відрізняються високими смаковими якостями. Для цих сортів характерна наявність незамінних амінокислот в більшій кількості. Таким чином, методом амінокислотного аналізу білків можна виявити різницю в складі амінокислот у контрастних за стійкістю до раку сортів картоплі. Отримані дані по вивченню амінокислотного складу білків мають значення в селекції картоплі і можуть бути рекомендовані селекціонерам при підборі вихідних батьківських форм для схрещування і отримання стійких до раку гібридів картоплі. На фігурі показаний амінокислотний склад білків контрастних за ракостійкістю сортів картоплі Темп та Вале (у %). Літературні джерела: 1. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкий Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. - М.: Мир, 1982. - С.269-448. 2. Зеля А.Г., Романюк О.П., Мельник П.О., Костишин С.С. Деклараційний патент на винахід №38722, МКВёА01С1/00, G01J3/28. Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schub) Perc. №2000095181. Заявл. 06.09.2000, опубл. 15.05.2001 // Офіційний бюлетень. Промислова власність, 2001. - №4, частина 2. - С14. 3. Плешков В.П. Методы биохимического анализа растений. - М.: Колос, 1978. - 326с. 4. Салтыкова Л.П. Обоснование подбора исходных форм для селекции картофеля на ракоустойчивость. // Рак картофеля и картофельная нематода. Черновцы. - 1984. - С.25-33. 5. Салтыкова Л.П., Тарасова В.П. Методические указания по испытанию картофеля на ракоустойчивость. Л.: 1988. - 51с. 6. Яковлева В.И., Салтыкова Л.П. Лабораторная диагностика ракоустойчивости картофеля методом заражения ростков от свежих раковых наростов. // Методические указания. М.: 1979. - 9с. 7. Яковлева Н.Н., Кадирматов И.Н. Авторское свидетельство СССР №380264. МКИ А01. Способ определения ракоустойчивости картофеля. №02/30-15. Заявл. 23.09.1971. Опубл. 15.09.1973. 10504 Я Темп • Вале Додаток 1 Таблиця 1 Реакція контрастних за ракостійкістю сортів картоплі на ураження збудником раку № п/п 1. 2. Сорт, гібрид Вале Темп Реакція на зараження + Додаток 2 Таблиця 2 Амінокислотний склад білків контрастних за ракостійкістю сортів картоплі (у %) № п/п Сорт картоплі Амінокислота 1. Лізин 2. Гістидин 3. Аргінін 4. Аспарагінова кислота 5. Треонін 6. Серин 7. Глютамінова кислота 8. Пролін, оксипролін 9. Гліцин 10. Аланін 11. Цистеїн, цислін 12. Валін 13. Метіонін 14. Ізолейцин 15. Лейцин 16. Тирозин 17. Фенілаланін 18. Триптофан 19. Аміак Сума незамінимих кислот Загальна сума Примітка: різниця між амінокислотами достовірна (Р