Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові

Реферат: Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові передбачає охолодження клітин у кріозахисному середовищі, що містить 7,5 % ДМСО, зі швидкістю 1 град/хв. до -60 °C з наступним зануренням у рідкий азот. У кріозахисне середовище додатково вводять антиоксидант N-ацетил-L-цистеїн у концентрації 10-15 мМ. UA 108501 U (12) UA 108501 U UA 108501 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі кріобіології і кріомедицини і може бути використана для зберігання ядровмісних клітин кордової крові (ЯВК) з метою їх подальшої трансфузії. Відомий спосіб кріоконсервування ЯВК у кріозахисному середовищі, що містить 10 % ДМСО. Охолодження здійснюють зі швидкістю 1 °C/хв. до температури -60 °C з подальшим зануренням у рідкий азот. Схоронність ЯВК, визначена за методом суправітального забарвлення трипановим синім, після розморожування становить 88,7±14,1 % [1]. Недоліком способу є те, що після кріоконсервування збільшується кількість клітин з підвищеним вмістом активних форм кисню (АФК), що призводить до оксидативного стресу, деструкції внутрішньоклітинних органел та загибелі клітин. Найбільш близьким до заявленого є спосіб кріоконсервування ЯВК кордової крові людини у кріозахисному середовищі, що містить 7,5 % ДМСО. Клітини охолоджують зі швидкістю 1 °C/хв. до температури -60 °C з подальшим зануренням у рідкий азот. Показники схоронності та життєздатності ЯВК, визначені за методом проточної цитофлуориметрії, становлять 88,62±27,67 % та 81,73±9,2 %, відповідно [2]. Недоліком цього способу також є збільшення кількості клітин з підвищеним вмістом АФК після кріоконсервування, що впливає на ефективність трансфузії. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування ЯВК кордової крові, в якому би, шляхом введення до кріозахисного середовища антиоксиданту, забезпечувалась можливість зменшити кількість клітин з підвищеним вмістом АФК. Ця задача вирішується тим, що у способі кріоконсервування ЯВК кордової крові, який передбачає охолодження клітин у кріозахисному середовищі, що містить 7,5 % ДМСО, до -60 °C зі швидкістю 1 °C/хв. з наступним зануренням у рідкий азот, згідно з корисною моделлю, у кріозахисне середовище додатково вводять антиоксидант N-ацетил-L-цистеїн у концентрації 1015мМ. Введення антиоксиданту N-ацетил-L-цистеїну у кріозахисне середовище дає можливість зменшити кількість клітин з підвищеним вмістом АФК у 2,3 рази порівняно з прототипом, при цьому показники схоронності та життєздатності достовірно не відрізняються від показників прототипу. Таким чином заявлений спосіб дозволяє отримувати після кріоконсервування клітини ЯВК більш ефективні при трансфузії. Спосіб пояснюється прикладами. Приклад 1. В якості джерела ЯВК використовували кордову кров, отриману після нормальних пологів, при наявності інформованої згоди породіллі. Матеріал було заготовлено на консерванті "Глюгіцир". Фракцію ЯВК кордової крові виділяли методом седиментації з використанням 6 %-го розчину поліглюкіну з м.в. 60000. Для кріоконсервування ЯВК кордової крові використовували кріозахисні середовища, що містять 7,5 % ДМСО, без та з додаванням 10-15 мМ антиоксиданту N-ацетил-L-цистеїну. Зразки охолоджували в програмному заморожувачі зі швидкістю 1 град/хв. до -60 °C з наступним зануренням у рідкий азот. Відтавання здійснювали на водяній бані (37 °C) при постійному погойдуванні до зникнення твердої фази. Абсолютну кількість клітин підраховували в камері Горяєва. Схоронність клітин обчислювали як відношення кількості клітин в досліджуваному зразку до кількості клітин у + контролі, помноженому на 100. Життєздатність ЯВК (CD45 - клітини) оцінювали за стандартним ISHAGE протоколом з використанням моноклонального антитіла CD45FITC і ДНК-барвника 7+ аміноактіноміціну D (7AAD) [3]. Відсоток життєздатних ЯВК (CD45 7AAD ) визначали за цитограмами в координатах CD45FITC і 7AAD. Результати вимірювань оцінювали за допомогою програмного забезпечення CELLQuest Pro. Кількість клітин з надмірним вмістом АФК визначали на проточному цитофлуориметрі FACS Calibur за накопиченням в них високолюмінесцентного 2',7'-діхлорофлуресцеіна. В Таблиці 1 показані дані щодо кількості ЯВК кордової крові, які містять надмірну кількість АФК, а також показники схоронності та життєздатності ЯВК після їх кріоконсервування у кріозахисному середовищі, що містить ДМСО (7,5 %), з додаванням та без додавання антиоксиданту N-ацетил-L-цистеїну. Наведені дані свідчать, що після кріоконсервування спостерігається виражене збільшення вмісту АФК в ЯВК порівняно з даними, отриманими до кріоконсервування. Антиоксидант Nацетил-L-цистеїн, доданий до кріозахисного середовища, сприяє зниженню внутрішньоклітинного вмісту АФК за рахунок активації антиоксидантних процесів в клітинах, при цьому зберігаються високі показники схоронності та життєздатності. Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що брали різні концентрації антиоксиданту N-ацетил-L-цистеїну у кріозахисному середовищі. Дані наведені в Таблиці 2. 1 UA 108501 U Отримані результати свідчать, що найменша кількість клітин з надмірним вмістом АФК була після кріоконсервування в кріозахисному розчині з концентрацією N-ацетил-L-цистеїну 10-15мМ. Таблиця 1 Показники стану ЯВК до та після кріоконсервування Кількість ЯВК з надмірним вмістом АФК до заморожування, % Кількість ЯВК з надмірним вмістом АФК після кріоконсервування без N-ацетил-Lцистеїну, % Кількість ЯВК з надмірним вмістом АФК після кріоконсервування з N-ацетил-Lцистеїном, % Схоронність ЯВК після кріоконсервування без N-ацетил-L-цистеїну, % Схоронність ЯВК після кріоконсервування з N-ацетил-L-цистеїном, % Життєздатність ЯВК після кріоконсервування без N-ацетил-L-цистеїну, % Життєздатність ЯВК після кріоконсервування з N-ацетил-L-цистеїном, % 10,3±1,8 20,6±2,1 9,1±1,0 78,0±4,1 84,6±6,8 78,5±4,2 80,5±3,9 Таблиця 2 Показники стану ЯВК в залежності від концентрації антиоксиданту N-ацетил-L-цистеїну у кріозахисному середовищі Кількість ЯВК, % Схоронність, % Життєздатність, % 0мМ 20,6±2,1 5мМ 10,3±1,4 78,8±6,2 77,8±3,6 10мМ 8,7±0,6 83,9±4,3 80,1±3,9 15мМ 9,1±1,0 84,6±6,8 80,5±3,9 30мМ 11,3±2,1 79,7±5,8 77,2±3,6 5 10 Джерела інформації: 1. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А. Заготовка и лабораторное тестирование гемопоэтических клеток пуповинной крови // Трансфузиология.-2003. - № 4(1). - С. 25-33. 2. Beaujean F., Bourhis J.H., Jouault H. et al. Successful cryopreservation of purified autologous CD34+cell: influence of freezing parameters on cell recovery and engraftment // Bone Marrow Transplant.-1998.- Vol. 22.- P. 1091-1096. 3. Schmid I. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color laser flow cytometry / I. Schmid, W.J. Krall, C.H. Uittenbogaart // Cytometry.-1992.- Vol.13.- P. 204208. 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, який передбачає охолодження клітин у кріозахисному середовищі, що містить 7,5 % ДМСО, зі швидкістю 1 град/хв. до -60 °C з наступним зануренням у рідкий азот, який відрізняється тим, що у кріозахисне середовище додатково вводять антиоксидант N-ацетил-L-цистеїн у концентрації 10-15мМ. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2