Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин у складі цільної кордової крові

Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин у складі цільної кордової крові, що включає повільне охолодження в присутності кріопротектора і подальше занурення в рідкий азот, який відрізняється тим, що як кріопротектор використовують аутологічну плазму, а охолодження проводять до –20 °С з наступною 20хвилинною стабілізацією при даній температурі. Винахід належить до галузі кріобіології і може бути використаний в медицині з метою проведення імуномоніторинга хворих на різних етапах розвитку захворювання. Відомий спосіб кріоконсервування ядровміщуючих клітин кордової крові людини, згідно з яким спочатку в градієнті щільності видаляють еритроцити, а потім до суспензії клітин додають 20 % діметилсульфоксид (ДМСО) до кінцевої концентрації 10 %. Заморожування проводять шляхом програмного охолодження зі швидкістю 1°С/хв. до -40°С, потім зі швидкістю 10°С/хв до -100°С, з подальшим переносом контейнера з клітинною суспензією у рідкий азот [1]. Основним недоліком способу є його складність, пов'язана з необхідністю попереднього виділення ядровміщуючих клітин із цільної кордової крові і проведення багаторазового відмивання клітинної суспензії від кріопротектора ДМСО. Найбільш близьким до заявленого є спосіб кріоконсервування ядровміщуючих клітин кордової крові людини у складі цільної кордової крові, який включає повільне (1°С/хв) охолодження в присутності 10 % ДМСО до -80°С з послідуючим зануренням в рідкий азот, відігрів і багаторазове відмивання [2]. Недоліки способу: 1. Зниження фагоцитарної активності зрілих гранулоцитів [3]. 2. Повна втрата окислювальновідновлювального потенціалу фагоцитів [3]. 3. Необхідність багаторазового відмивання клітин від кріопротектора, яке ускладнює процес кріоконсервування і справляє негативну дію на морфофункціональні властивості клітин. В основу винаходу поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування ядровміщуючих клітин у складі цільної кордової крові, у якому б, за рахунок заміни кріопротектора і зміни програми заморожування, забезпечилась (19) UA (11) 81368 (13) (21) a200607817 (22) 12.07.2006 (24) 25.12.2007 (72) ЦУЦАЄВА АЛЛА ОЛЕКСАНДРІВНА, UA, ГРИЩЕНКО ВАЛЕНТИН ІВАНОВИЧ, UA, ЖЕЛТЯКОВА ІРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, UA, БРОВКО ОЛЕНА ВАЛЕРІЇВНА, UA, ЧЕРНОУСОВА СВІТЛАНА СЕРГІЇВНА, UA, ПЕЩАНСЬКИЙ МИКОЛА ІВАНОВИЧ, UA (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, UA (56) UA A 31847, 15.12.2000. UA A 30014, 15.11.2000. UA A 60238, 15.09.03. Rubinstein P., Dobrila L., Rosenfield R.E., et. al. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92(22). - P. 10119-10122. Meryman H.T., Howard G. Cryopreservation of granulocytes. - In: The granulocyte: Function and C2 1 3 можливість підвищити фагоцитарну активність зрілих гранулоцитів і зберегти їх окислювальновідновлювальний потенціал, при одночасному спрощенні процесу кріоконсервування. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування ядровміщуючих клітин у складі цільної кордової крові, який включає повільне охолодження в присутності кріопротектора і подальше занурення в рідкий азот, згідно з винаходом, в якості кріопротектора використовують аутологічну плазму, а охолодження проводять до -20°С, з наступною 20хвилинною стабілізацією при даній температурі. Заявлений спосіб, в порівнянні з прототипом, дозволяє вірогідно збільшити число фагоцитуючих клітин (табл. 2) і повністю зберегти їх окислювально-відновлювальний потенціал (табл. 3), при цьому збереженість ядровміщуючих клітин залишається на рівні прототипу (табл. 1). Крім того спосіб спрощується за рахунок виключення процедури відмивання клітин від кріопротектора. Позитивний вплив аутологічної плазми на ядровміщуючі клітини кордової крові зв'язаний з високим вмістом у ній високомолекулярних білків, які знижують інтенсивність дії на клітини концентраційних градієнтів ведучого ушкождуючого фактора, який реалізується на етапах заморожування [4]. Повільне охолодження клітин до -20°С з зупинкою при -20°С протягом 20 хвилин сприяє створенню дрібнокристалічних структур льоду, щадному обезводненню клітин, зниженню ступеню вираженості сольових градієнтів та дозволяє стабілізувати системи в зоні низьких температур [5]. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Зразки кордової крові людини вміщували в пластикові одноразові контейнери, які герметично запаювали і кріоконсервували за 2 етапною програмою, згідно якій на першому етапі проводили охолодження в програмному заморожувачу зі швидкістю 1°С/хв до -20°С з наступною стабілізацією при даній температурі, а на другому - швидке занурення в рідкий азот. Зберігання зразків здійснювали в рідкому азоті при температурі -196°С. Відігрів матеріалу проводили у водяній бані при температурі 40-41°С. Після відігріву досліджували вплив кріоконсервування на морфофункціональні властивості ядровміщуючих клітин кордової крові. Результати показали, що кількість збережених клітин у суспензії, які визначали методом суправітального забарвлення, вірогідно не відрізнялась від показника прототипу (табл. 1). Кількість фагоцитуючих клітин в зразках кордової крові була вірогідно вища (табл. 2). Окислювально-відновлювальний потенціал фагоцитів, який визначали за їх здібністю відновлювати нітросиній тетразолій (НСТ-тест), вірогідно не відрізнявся від нативу (табл. 3). Кількість життєздатних клітин, які утворюють колонії в агарі (КУОк), вірогідно не відрізнялась від вмісту таких клітин в нативних зразках (табл.4). Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за виключенням того, що охолодження 81368 4 зразків проводили як в прототипі: до -80°С з наступним зануренням в рідкий азот. Результати подані в таблиці 5. З таблиці видно, що кількість збережених і НСТ-позитивних клітин вірогідно не відрізнялась від показників нативних зразків, тоді як кількість фагоцитуючих клітин і КУОк була вірогідно нижча. Приклад 3. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за виключенням того, що в якості кріопротектора використовували ДМСО. Досліди відігрітих зразків показали, що кількість збережених ядровміщуючих клітин вірогідно не відрізнялась від показників нативних, тоді як кількість фагоцитуючих, НСТ-позитивних клітин і КУОк була вірогідно нижча (табл. 5). Показники збереженості ядровміщуючих клітин кордово Спосіб Кількість збереже Прототип Заявлений Фагоцитарна активність ядровміщуючих клітин кордової кр Спосіб Кільк Нативний зразок Прототип Заявлений Примітка: * - (р