Спосіб епігенетичного культивування аутологічних дермальних фібробластів людини

Реферат: Спосіб епігенетичного культивування аутологічних дермальних фібробластів людини включає застосування живильного середовища DMEM, сироватки великої рогатої худоби. Використовують живильне середовище DMEM, 10 % бичої сироватки (FBS), 9 нг/мл фібробластних факторів росту, 1 % пеніциліну, 1 % сульфату стрептоміцину, 1 % L-глютаміну і 10 % аутологічної плазми, збагаченої тромбоцитами. UA 110281 U (54) СПОСІБ ЕПІГЕНЕТИЧНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ АУТОЛОГІЧНИХ ДЕРМАЛЬНИХ ФІБРОБЛАСТІВ ЛЮДИНИ UA 110281 U UA 110281 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології, дерматології, естетичної медицини і може бути використана для культивування аутологічних дермальних фібробластів людини (ДФЛ). Відомо, що шкіра людини внаслідок інволюційно-дистрофічних змін втрачає свої фізіологічні властивості, що важко піддається корекції. Найближчим аналогом до корисної моделі є спосіб культивування ДФЛ із застосуванням середовища, яке містить 90 % середовища DMEM, 5 % сироватки великої рогатої худоби і 5 % пуповинної сироватки людини [1]. Недоліком найближчого аналога є повільне зростання фібробластів, що є незручним для клінічного впровадження. Окрім того, за даними досліджень, одним із головних механізмів, що викликають репликативне старіння фібробластів, є скорочення довжини тіломірів - кінцевих відділів хромосом, які слугують для підтримання цілісності геному клітини. Відомо, що довжина тіломіру фібробласту з кожним поділом клітини зменшується приблизно на 150 основ, що сприяє обмеженню числа клітинних поділів, які складають у середньому 50±10 [2]. По мірі старіння популяції ДФЛ, які знаходяться під контролем генетичних та епігенетичних факторів, відмічається значне зниження проліферативного потенціалу. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалення способу культивування ДФЛ шляхом додавання до живильного середовища плазми, збагаченої тромбоцитами, що дозволяє отримувати активні форми фібробластів за рахунок епігенетичного культивування аутологчіних (власних клітин шкіри пацієнта) дермальних фібробластів з довгими тіломерами та високою генною експресією для ефективного використання в практичній медицині. Поставлена задача вирішується тим, що епігенетичне культивування аутологічних фібробластів людини виконують шляхом застосування живильного середовища DMEM, сироватки великої рогатої худоби, що містить 10 % бичої сироватки (FBS), 9 нг/мл фібробластних факторів росту, 1 % пеніциліну, 1 % сульфату стрептоміцину, 1 % L-глютаміну і 10 % аутологічної плазми, збагаченої тромбоцитами. Корисну модель виконують наступним чином. Зразки тричі ретельно промивають у натрій-фосфатному буферному розчині, що містить по 1 % пеніциліну і сульфату стрептоміцину. Далі тканину переробляють в 0.5 % Dispase II за 1 добу при температурі 4 °C. Епідерміс та підшкірну тканину розділюють на фрагменти приблизно 110.5 см, потім у вигляді експлантатів поміщують в контейнери Т25 для культивації тканин. Як живильне середовище використовують DMEM, до якого додають 9 нг/мл фібробластних факторів росту, 1.0 г/L D-глюкози, 10 % бичої сироватки (FBS), 1 % пеніциліну, сульфату стрептоміцину, 2 мМ Л-глютаміну і 10 % аутологічної плазми, збагаченої тромбоцитами. Дане середовище змінювали кожні 3 дні. Клітини вирощували при температурі 37 °C в атмосфері 5 % СО2. Отримані шляхом епігенетичного культивування аутологічні дермальні фібробласти людини виявили підвищення експресії генів COL1A, ТІМР1, ММР2, МТ1А1, яку обчислювали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, зі зворотною транскрипцією шляхом ампліфікації специфічного фрагменту рибонуклеїнової кислоти (РНК), а саме на 10 %, що демонструє фіг. 1, де зображена зведена таблиця експресії генів в культурі фібробластів в залежності від умов культивування. Збільшення довжини тіломірів, які слугують для підтримання цілісності геному клітини, відбулося у 1,5 рази, що ілюструє фіг. 2, де відносна довжина тіломерів фібробластів в культурі в залежності від терміну культивування Графік демонструє результати культивування фібробластів у вигляді збільшення відносної довжини тіломірів фібробластів, які культивують. Довжину тіломірів обчислювали за допомогою пристрою моніторування на підставі протоколу, описаного Cawthon [3] і зміненого Gil і Coetzer. [4]. Таким чином у порівнянні з найближчим аналогом, корисна модель дозволяє культивувати найбільш активні форми аутологічних детальних фібробластів людини, що дозволить використовувати значно меншу кількість клітин для досягнення необхідного клінічного ефекту при використанні в практичній дерматології. Джерело інформації: 1. Черников В.Г., Шпшин С.С. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2000, - № 5. - С. 587-590. 2. Allsopp et al., Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992; 89:10114-10118. 3. Cawthon R. M. Telomere measurement by quantitative PCR // Nucleic Acids Research. 2002; 30 (10) p. 47e-47. 1 UA 110281 U 4. Gil ME, Coetzer TL. Real-time quantitative PCR of telomere length // Моl. Biotechnol. 2004 Jun; 27(2): 169-72. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб епігенетичного культивування аутологічних дермальних фібробластів людини, що включає застосування живильного середовища DMEM, сироватки великої рогатої худоби, який відрізняється тим, що використовують живильне середовище DMEM, 10 % бичої сироватки (FBS), 9 нг/мл фібробластних факторів росту, 1 % пеніциліну, 1 % сульфату стрептоміцину, 1 % L-глютаміну і 10 % аутологічної плазми, збагаченої тромбоцитами. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2