Спосіб культивування хондроцитів міжхребцевих дисків людини

Реферат: UA 92167 U UA 92167 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біотехнології, клітинної біології та регенеративної медицини і може бути застосована для нарощування in vitro клітин людини у терапевтичній кількості без застосування компонентів тваринного походження в процесі експансії даного клітинного типу - хондроцитів пульпозного ядра (ХЦПЯ) міжхребцевих дисків людини. Відомий спосіб довготривалого культивування фрагментів міжхребцевих дисків людини та ізольованих з них клітин з подальшим нарощуванням клітинної маси з використанням 10-20 % ембріональної телячої сироватки [Пат. DE3713197 (А1) ЕР Register, МПК C12N5/02; C12N5/077; A01N1/02; C12N5/00; C12N9/50. Method for the long-term culture of intervertebral discs and cell cultures which can be isolated therefrom / Markert K. O. [DE]; заявник та патентоутримувач KNOLL AG [DE]. № DE19873713197 19870418; заявл. 18.04.87; опубл. 03.11.88, http://worldwide.espacenet.com]. Прототипом нашого способу вибрано запатентований метод продукції клітин міжхребцевих дисків людини, котрий полягає в тому, що клітини нарощують в умовах моношарової культури в ростовому середовищі з використанням як мітогенного домішку субстанції тваринного походження - 10 % ембріональної телячої сироватки (ETC) [Пат. 6080579 США, МПК C12N 5/00; C12N 5/06; А61K 35/12; А61K 38/00; C12N 005/00; C12N 005/08. Method for producing human intervertebral disc cells / Hanley E. N., Gruber H. E.; заявник та патентоутримувач CharlotteMecklenburg Hospital Authority (Charlotte, NC, США). - № 08/979674; заявл. 26.11.97; опубл. 27.06.00, http://patft.uspto.gov.] Проте, за даними способами клітини культивуються з додаванням до ростового середовища субстанції тваринного походження - 10 % ETC, недоліком якої є можливості потенційної імунізації тваринними білками пацієнта та передачі патогенних збудників інфекції, зокрема вірусів, при трансплантації йому культивованих таким чином клітин. В основу даної корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб культивування хондроцитів міжхребцевих дисків людини шляхом заміни субстанції тваринного походження ETC на мітогенну та гормональну домішку, виготовлену з цільної крові людини, що дозволяє досягти того самого мітогенного ефекту в порівнянні з ETC, але уникнути ризику потенційної імунізації пацієнта тваринними білками та потенційної передачі йому патогенних збудників інфекції при трансплантації культивованих клітин. Поставлена задача вирішується тим, що в способі, який включає культивування в ростовому середовищі хондроцитів з додаванням мітогенної субстанції, згідно з даною корисною моделлю, як мітогенну та гормональну субстанцію використовують 10 % АВ-сироватку і 10 % АВтромбоцитарний лізат, котрі виготовлені з цільної крові людини. Подібний до прототипу мітогенний ефект щодо культури клітин досягається за рахунок використання гомологічної АВ-сироватки та АВ-тромбоцитарного лізату з цільної крові людини, що містять білкові фактори росту, гормони, цитокіни та молекули позаклітинного матриксу, які діють як мітогени, регулятори поведінки клітин у культурі та опосередкуючі адгезію компоненти для ефективного культивування клітин. Спосіб, що заявляється, виконується наступним чином ХЦПЯ людини культивують в стандартному поживному середовищі в 24-ямкових плашках 3 (Costar, США) в кількості 10 /ямку з додаванням як мітогенної та гормональної домішки таких субстанцій: донорська АВ-сироватка людини 10 % та донорський 10 % АВ-тромбоцитарний лізат людини. Донорську сироватку одержують шляхом інкубації цільної крові без додавання розчину антикоагулянту в пробірці за 37 °C протягом 30 хв. з подальшим центрифугуванням за 1500 об./хв. протягом 15 хв., та надалі піпеткою відбирають сироватковий надосад. Тромбоцитарний лізат одержують з донорської цільної крові з додаванням 10 % розчину антикоагулянту ACD-A (Baxter S.A., Бельгія) та подальшим двоетапним центрифугуванням плазми та збагаченої тромбоцитами плазми з кінцевою кріоактивацією тромбоцитарного лізату за допомогою рідкого азоту (-196 °C). Темпи проліферації клітин оцінюють в усіх групах за допомогою непрямого напівкількісного спектрофотометричного методу з використанням 1 % розчину толуїдинового блакитного (Sigma, США) з 1 % тетраборнокислим натрієм (Макрохім, Україна), котрий відображає проліферативну активність клітин за кількістю зв'язаного та надалі вимитого барвника: менше барвника, що зв'язався, та нижчий показник оптичної щільності, - менше проліферуючі культури, та навпаки. Після зв'язування культурами барвника, його вимивають 1 % розчином оцтової кислоти, відбирають по 6 аліквот (300 мкл) розчину зі зв'язаним та вимитим барвником з кожної групи та вимірюють оптичну щільність одержаних розчинів за допомогою імуноферментного аналізатора, наприклад, Sunrise Remote 3.x та ПЗ Magellan V4.00, ВО 17600 (Тесап., Австрія). 1 UA 92167 U 5 10 15 За результатами дослідження ефекту культивування ХЦПЯ в ростових середовищах без додавання гетерологічних субстанцій, як мітогенної та гормональної домішки, були одержані наступні результати. Виявлено, що найвищі темпи проліферації клітин - ХЦПЯ (100 %), за показниками оптичної щільності, спостерігалися в живильному середовищі DMEM/F12 з додаванням 10 % АВ-сироватки людини: 0,14 од. (табл. 1); 17 % в ETC 10 контролі відповідно; і 10 % АВ-тромбоцитарного лізату людини: 0,25 од. (див. табл.); 10 % в ETC 10 контролі відповідно (кресл.). При цьому контрольними групами були ті, де додавали 10 % і 20 % ETC (гетерологічна субстанція тваринного походження). В порівнянні з домішкою тваринного походження - 10 % і 20 % ETC, як згідно з нашими дослідженнями, так і у порівнянні з прототипом [Пат. 6080579 США, МПК C12N 5/00; C12N 5/06; А61K 35/12; А61K 38/00; C12N 005/00; C12N 005/08. Method for producing human intervertebral disc cells / Hanley E. N., Gruber H. E.; заявник та патентоутримувач Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority (Charlotte, NC, США). - № 08/979674; заявл. 26.11.97; опубл. 27.06.00, http://patft.uspto.gov.], клітинні культури ХЦПЯ, що нарощувалися в присутності АВ-сироватки і АВ-тромбоцитарного лізату людини, мали збільшені темпи проліферації, що є позитивним ефектом щодо кількості нарощуваних клітин. Таблиця Значення оптичної щільності розчину вимитого барвника з досліджуваних груп ХЦПЯ, культивованих без додавання гетерологічних субстанцій, за зв'язуванням толуїдинового блакитного/тетраборнокислого натрію, оптичних одиниць м ±m N P1 Р2 Р3 р4 ETC 10 0,024 0,001 8 ETC 20 0,026 0,001 8 АВ-Сир 5 0,021 0,001 8 Р