Спосіб моделювання експериментальної травми товстої кишки у дрібних лабораторних тварин

Спосіб моделювання стандартизованого поранення товстої кишки у дрібних лабораторних тварин, при якому у білих щурів стандартизоване поранення товстої кишки виконується очними ножицями шляхом розсічення поперек кишкової стінки при довжині розрізу 2 мм. Корисна модель відноситься до галузі експериментальної медицини і може бути використана для вивчення особливостей реакції органів і функціональних систем організму на експериментальної травму товстої кишки. Проблема кровотеч з шлунково-кишкового тракту у теперішній час залишається актуальною. Зокрема гастродуоденальні кровотечі виразкової етіології є однією з головних причин стійкої втрати працездатності і супроводжуються високою летальністю [2, 4]. Шлунково-кишкові кровотечі різного генезу є серйозною загрозу для життя пацієнтів похилого і старечого віку, які зазвичай мають досить тяжкі супутні захворювання [1, 3, 7]. Розвиток сучасних методів консервативного терапії шлунково-кишкових кровотеч дозволив покращити результати лікування, однак у людей похилого і старечого віку гастродуоденальні кровотечі ускладнюються атеросклеротичним ураженням судин, артеріальною гіпертензією та віковими порушеннями гемостазу [5, 6]. Особливості вікових змін згортання крові вивчені недостатньо, що стримує процес оптимізації лікування кровотеч з шлунково-кишкового тракту у хворих похилого і старечого віку. У даному випадку особливого значення набувають локальні патогенетичні процеси, дослідити які в умовах клініки важко, проте можливо вивчити експериментальне. У свою чергу, існуючі способи моделювання поранення шлунка у крупних лабораторних тварин (кішка, кролик) не дають можливості швидко отримати достатню за кількістю вибірку для статистичного аналізу, а досліди на собаках у теперішній час взагалі заборонені. Мета корисної моделі. Розробити спосіб моделювання експериментальної травми товстої кишки у дрібних лабораторних тварин (білі щури). Поставлена мета досягається тим, що після введення щурів в наркоз і лапаротомії експериментальна травма товстої кишки виконується очними ножицями, шляхом розсічення поперек кишкової стінки при довжині розрізу 2мм. Результати експериментальних досліджень. У роботі використано 75 статевозрілих і 75 старих самців білих щурів з масою тіла 0,14-0,16кг (статевозрілі тварини віком 4-6міс.) та 0,49-0,55кг (старі тварини віком 20-22міс). Усі операційні втручання проводились відповідно до основних вимог Ванкуверських конференцій (1979, 1994) про біомедичні експерименти щодо гуманного відношення до лабораторних тварин, в асептичних умовах, під уретановим наркозом (ЮООмг на 1кг маси тіла). Після серединної лапаротомії вдовж білої лінії живота експериментального поранення товстої кишки у статевозрілих і старих щурів виконували очними ножицями, розсікаючи поперек кишкову стінку. Довжина розрізу складала 2мм (Фіг.1, 2). У всіх випадках після поранення товстої кишки на розріз черевної порожнини накладали 5 швів, що запобігало тепловим втратам. Дослідження змін параметрів тканинного протеолізу виконувалось серійно (по 15 тварин у серії) - через ЗО, 60, 120 і 180хв. після поранення товстої кишки. Після евтаназії тварин шляхом забору крові з черевної аорти наважки товстої кишки одразу заморожували в рідкому азоті. Перед дослідженням тканинного протеолізу наважки розморожували, CO О) 11137 гомогенізували в 2,0мл охолодженого боратного буферу (рН 9,0) і надалі використовували в біохімічному аналізі Дослідження протеолітичної активності тканини товстої кишки проводили за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу (Україна) Принцип методу полягає в тому, що при інкубації білкових азосполук в присутності активаторів та інгібіторів протеолізу, які містяться у тканині товстої кишки, відбувається лізис азоальбуміну (деградація низькомолекулярних протеїнів), азоказеїну (розпад високомолекулярних білків) та азоколу (колагеноліз), інтенсивність якого оцінюється за ступенем забарвлення інкубаційного розчину в лужному середовищі По 0,1мл гомогенату тканини товстої кишки вносили у пробірки, які містили 5мг азосполуки і 1,9мл боратного буферу (рН 9,0) У дублікати пробірок "РП" (розчин порівняння) замість гомогенату товстої кишки додавали 0,1 мл боратного буферу Усі пробірки одночасно інкубували у водяному термостаті "ТПС-1" при температурі 37°С протягом 15хв За цей проміжок часу відбувається розпад азосполук і вивільнення барвника в інкубаційний розчин ВІДПОВІДНО протеолітичній активності тканини товстої кишки Після інкубації усі пробірки одночасно охолоджували до 5°С для зупинки лізису азосполук У кожну пробірку для залужування середовища додавали по 20мкл 5М розчину NaOH До усіх пробірок додавали 2,0мл дестилірованої води, вміст фільтрували через шар вати, що знаходилась у шприцах На спектрофотометрі "СФ-46" (Росія) у кюветах товщиною 1см при довжині хвилі 440нм проти розчину порівняння проводили замір оптичної густини проб Отримані екстинцп перераховували на мкг азосполуки на 1г селезінкової тканини за 1год інкубації за формулою лізис азосполуки = (Е44ох1000х4хк) п=мкг азосполуки / 1 г тканини товстої кишки за 1 год , де k - коефіцієнт перерахунку, п - наважка тканини товстої кишки (мг) Статистичну обробку отриманих даних проводили методом варіаційного аналізу на PC IBM 586 з визначенням критерію Стьюдента за допомогою програми "BioStat" Результати дослідження динаміки змін протеолітичної активності у тканині товстої кишки наведені у таблиці У статевозрілих щурів інтенсивність розпаду низькомолекулярних білків у тканині товстої кишки після ґі поранення впродовж перших ЗО хв досліду не змінювалась На 60-у хв експерименту локальна альбумінолітична активність збільшувалась на 84,6%, на 120-у хв - перевищувала вихідний рівень у 2,7 разу, а на 180-у хв експерименту виявилась у 4,0 рази більшою за контроль Зовсім ІНШІ ЗМІНИ спостерігались у старих щурів лізис азоальбуміну підвищувався у 3,2 разу на 60у хв досліду, був на 56,9% більшим за контрольні показники на 120-у хв , проте на 180-у хв спостереження різко знижувався і достовірно від вихідного рівня не відрізнявся У статевозрілих і старих щурів визначальна альбумінолітична активність тканини товстої кишки була практично рівною Порівняльний аналіз не виявив міжгрупових відмінностей зазначеного показника і через ЗОхв після поранення товстої кишки На 60-у хв досліду лізис альбуміну виявився на 46,5% більшим у старих тварин Однак надалі інтенсивність розпаду низькомолекулярних білків у тканині пораненої товстої кишки старих щурів була значно меншою за таку у статевозрілих тварин на 120-у хв - ВДВІЧІ, на 180у хв - у 3,7 разу Подібні зміни спостерігались і з боку протеолітичної деградації високомолекулярних білків У статевозрілих щурів після поранення товстої кишки відбувалось прогресивне підвищення казеїнолітичної активності м тканини, тоді як у старих тварин різке підвищення лізису азоказеїну на 60-у хв експерименту змінювалось поступовим зниженням інтенсивності розпаду високомолекулярних білків Проте наприкінці спостереження лізис азоказеїну залишався на 43,7% більшим за контрольні показники Порівняльний аналіз не виявив достовірної різниці між визначальною казеїнолітичною активністю у старих і статевозрілих щурів, так само, як і через перші ЗОхв після поранення товстої кишки На 60-у хв досліду інтенсивність розпаду високомолекулярних білків була на 32,7% більшою у старих щурів Надалі, навпаки, лізис азоказеїну у старих тварин виявився значно меншим, ніж у статевозрілих щурів на 120-у хв - у 2,6 разу, на 180-ухв -у4,3 разу У статевозрілих тварин колагенолітична активність тканини товстої кишки впродовж першої години після й поранення достовірних змін не зазнавала На 120-у хв експерименту лізис аз околу виявився на 30,5% меншим за вихідний рівень, а на 180-у хв досліду був у 2,4 разу меншим за контроль У старих щурів змін локального колагенолізу також не відбувалось до 120-і хв досліду, коли колагенолітична активність тканини ушкодженої товстої кишки різко зростала і перевищувала контроль на 78,5% Наприкінці спостереження інтенсивність лізису аз околу в тканині товстої кишки старих тварин залишалась високою - на 51,5% більшою за ВИХІДНІ показники Визначальний рівень колагенолітичної активності у статевозрілих і старих щурів був практично однаковим Міжгрупових змін зазначеного показника не виявлялось і через ЗОхв після поранення товстої кишки На 60у хв досліду інтенсивність протеолітичного розпаду колагену була на 33,4% меншою у старих щурів, однак на 120-у і 180-у хв експерименту колагеноліз у тканин» ушкодженої товстої кишки старих тварин перевищував такий у статевозрілих щурів ВІДПОВІДНО у 2,1 і 2,9 разу Результати дослідження підтверджують високий ступінь стандартизації поранення товстої кишки, що зокрема дозволяє визначити різницю змін інтенсивності тканинного протеолізу у статевозрілих і старих щурів ВІДПОВІДНІСТЬ критерію "новизна" даного способу забезпечує те, що на дрібних лабораторних тваринах (білі щури) виконується експериментального поранення товстої кишки ВІДПОВІДНІСТЬ критерію "суттєві ВІДМІННОСТІ" да ного способу забезпечує те, що на відміну від відомих раніше способів поранення товстої кишки стандартизоване травмування виконується очними ножицями, шляхом розсічення поперек кишкової стінки при довжині розрізу 2мм 11137 Відповідність даного винаходу критерію "позитивний ефект" забезпечується результатами експериментальних досліджень, які засвідчують ефе ктивність стандартизації поранення товстої кишки у дрібних лабораторних тварин (білі щури). Таблиця Динаміка змін тканинного протеолізу у щурів з пораненням товстої кишки (x±Sx) Періоди спостереження Контроль (ВИХІДНІ показники) Через ЗО хв. після поранення Через 60 хв. після поранення Через 120 хв. після поранення Через 180хв після поранення Статевозрілі щури п=15 Старі щури п=15 Лізис азоЛізис азока- Лізис азокоЛізис азока- Лізис азокоЛізис азоальбуміну, зеїну, мкг/ зеїну, мкг/ лу, мкг /1г альбуміну, лу, мкг/ 1г мкг /1г тка1 г тканини мкг /1 г ткатканини за 1 г тканини тканини за нини за нини за 1 год. за 1 год. 1год. за 1год. 1год. 1год. 16,55+1,71 14,01+1,18 10,91 ±1,06 16,56+1,61 13,55±1,45 19,67±1,44 Рі>0,05 Рі>0,05 Рі>0,05 18,94+1,57 15,34±1,35 13,88±1,46 22,71 ±2,11 19,77±1,65 16,28±1,80 р>0,05 Р>0,4 р>0,05 р>0,05 р>0,05 р>0,05 Рі=0,05 рі>0,05 Рі>0,05 59,35±4,81 53,21 ±4,33 9,51 ±0,85 14,27±1,67 36,31 ±3,06 44,74±4,05 р