Спосіб моделювання експериментальної травми тонкої кишки у дрібних лабораторних тварин

Спосіб моделювання експериментального поранення тонкої кишки у дрібних лабораторних тварин, при якому у білих щурів експериментальне поранення тонкої кишки виконується ножицями шляхом розсічення поперек кишкової стінки при довжині розрізу 1 мм. Корисна модель відноситься до галузі експериментальної медицини і може бути використаним для вивчення особливостей реакції органів і функціональних систем організму на експериментальне поранення тонкої кишки. Проблема кровотеч з шлунково-кишкового тракту у теперішній час залишається актуальною. Зокрема гастродуоденальні кровотечі виразкової етіології є однією з головних причин стійкої втрати працездатності і супроводжуються високою летальністю [2, 4]. Шлунково-кишкові кровотечі різного генезу є серйозною загрозу для життя пацієнтів похилого і старечого віку, які зазвичай мають досить тяжкі супутні захворювання [1, 3, 8]. Розвиток сучасних методів консервативного терапії шлунково-кишкових кровотеч дозволив покращити результати лікування, однак у людей похилого і старечого віку гастродуоденальні кровотечі ускладнюються атеросклеротичним ураженням судин, артеріальною гіпертензією та віковими порушеннями гемостазу [5, 6]. Особливості вікових змін згортання крові вивчені недостатньо, що стримує процес оптимізації лікування кровотеч з шлунково-кишкового тракту у хворих похилого і старечого віку. У даному випадку особливого значення набувають локальні патогенетичні процеси, дослідити які в умовах клініки важко, проте можливо вивчити експериментальне. У свою чергу, існуючі способи моделювання поранення шлунка у крупних лабораторних тварин (кішка, кролик) не дають можливості швидко отримати достатню за кількістю вибірку для статистичного аналізу, а досліди на собаках у теперішній час взагалі заборонені. Мета корисної моделі. Розробити спосіб експериментального поранення тонко)' кишки у дрібних лабораторних тварин (білі щури). Поставлена мета досягається тим, що після введення щурів в наркоз і лапаротомії експериментального поранення тонкої кишки виконується ножицями, шляхом розсічення поперек кишкової стінки при довжині розрізу 1 мм. Результати експериментальних досліджень. У роботі використано 75 статевозрілих і 75 старих самців білих щурів з масою тіла 0,14-0,16кг (статевозрілі тварини віком 4-6міс.) та 0,49-0,55кг (старі тварини віком 20-22міс). Усі операційні втручання проводились відповідно до основних вимог Ванкуверських конференцій (1979, 1994) про біомедичні експерименти щодо гуманного відношення до лабораторних тварин, в асептичних умовах, під уретановим наркозом (ЮООмг на 1кг маси тіла). Після серединної лапаротомії вдовж білої лінії живота стандартизоване поранення тонкої кишки у статевозрілих і старих щурів виконували очними ножицями, розсікаючи поперек кишкову стінку. Довжина розрізу складала 1мм. У всіх випадках після поранення тонкої кишки на розріз черевної порожнини накладали 5 швів, що запобігало тепловим втратам. Дослідження змін параметрів тканинного фібринолізу виконувалось серійно (по 15 тварин у серії) - через ЗО, 60, 120 і 180хв. після поранення тонкої кишки. Після евтаназії тварин шляхом забору крові з черевної аорти наважки тонкої кишки (кільцеві ділянки з прилеглих до поранення зон товщиною по 2мм) одразу заморожували в рідкому азоті. Перед дослідженням тканинного фібринолізу наважки ео 00 со О) 11138 розморожували, гомогенізували в 2,0мл охолодженого боратного буферу (рН 9,0) і надалі використовували в біохімічному аналізі. Сумарну (СФА), неферментативну (НФА) і ферментативну (ФФА) фібринолітичну активність тканини тонкої кишки визначали за допомогою азофібрину (Україна). Принцип методу: при інкубації азофібрину зі стандартною кількістю плазміногену в присутності активаторів та інгібіторів фібринолізу, що містяться у тканини тонкої кишки, утворюється плазмін, активність якого оцінюється за ступенем забарвлення розчину в лужному середовищі в присутності є-амінокапронової кислоти (неферментативна фібринолітична активність) або без неї (сумарна фібринолітична активність). Різниця між ними відповідає інтенсивності ферментативного фібринолізу. Визначення фібринолітичної активності тканини тонкої кишки проводили за методикою [7]. Гомогенати тканини тонкої кишки (0,5мл) розводили в 0,5мл боратного буфера (рН 9,0). По 0,5мл суміші вносили в 2 ряди пробірок із марками "СФА" (сумарна фібринолітична активність) і "НФА" (неферментативна фібринолітична активність). Пробірки "СФА" містили 1 мг азофібрину, 1 мг плазміногену (Україна) і 1мл боратного буфера (рН 9,0). У пробірки "НФА", крім того, додавали 5мг єамінокапронової кислоти, для пригнічення активності плазміну. У дублікати пробірок "РП" (розчин порівняння) замість гомогенату тканини тонкої кишки додавали 0,5мл боратного буфера. Усі пробірки одночасно інкубували у водяному термостаті "ТПС-8" при температурі 37°С впродовж 15хв. За цей період відбувається розпад азофібрину і вивільнення азобарвника в інкубаційний розчин пропорційно фібринолітичній активності тканини тонкої кишки. Після інкубації всі пробірки одночасно охолоджували до 5°С з метою припинення лізису азофібрину. У кожну пробірку додавали по 20мкл 5 М розчину NaOH для створення лужного середовища. Потім вміст пробірок фільтрували через прошарок вати, що утримувався в шприцах. На спектрофотометрі "СФ-46" (Росія) при довжині хвилі 440 нм вимірювали оптичну щільність проб. Отримані екстинції перераховували в мкг азофібрину на 1 г тканини тонкої кишки за 1 год інкубації за формулою: СФА (НФА)=(Е44ох4х1ОООхк): п(мг)=мкг азофібрину/1 г тканини тонкої кишки за 1 год., де п - маса наважки органу, k - коефіцієнт перерахунку. Статистичну обробку отриманих даних проводили методом варіаційного аналізу на PC IBM 586 з визначенням критерію Стьюдента за допомогою програми "BioStat". Результати дослідження динаміки змін фібринолітичної активності у тканині тонкої кишки статевозрілих і старих щурів з пораненням тонкої кишки наведені у таблиці. У статевозрілих щурів у відповідь на поранення тонкої кишки її тканинна сумарна фібринолітична активність підвищувалась: на 60-у хв. - на 24,4%, на 120-у хв. - на 40,1%, на 180у хв. - на 36,6%. У старих тварин спостерігалось більш швидке і більш виражене зростання тканинного фібринолізу: СФА вже через ЗО хв. перевищувала контрольні показники на 28,4%, через 60хв. - на 68,3%, через 120хв. - у 2,3 разу, через 120хв. - у 2,7 разу. Варто зазначити, що визначальний рівень СФА у статевозрілих і старих щурів достовірно не відрізнявся. Порівняльний аналіз показав, що після поранення тонкої кишки СФА її тканини у старих щурів виявилась більш високою впродовж всього періоду спостереження: через 30хв. - на 33,8%, через 60хв. - на 55,8%, через 120хв. - на 87,7%, через 120хв. - у 2,3 разу. Неферментативна фібринолітична активність після поранення тонкої кишки у статевозрілих щурів зростала недостовірне. У старих щурів збільшення СФА у тканинах прилеглих до поранення тонкої кишки зон починалось на 60-у хв. досліду, коли інтенсивність неензиматичного лізису фібрину перевищувала контроль на 30,4%. Через 120хв. НФА була більшою за контроль на 66,1%, через 180хв. - на 46,3%. Варто зазначити, що у старих тварин вихідний рівень неферментативного фібринолізу в тканині тонкої кишки був на 50,1% вищим, ніж у статевозрілих щурів. Крім того, НФА тканини тонкої кишки у старих щурів була більшою за таку у статевозрілих тварин протягом всього експерименту: через 60хв. - на 56,1%, через 120хв. - на 64,2%, через 120хв. - у 2,4 разу, через 120хв. у 2,0 рази. У відповідь на поранення тонкої кишки у статевозрілих щурів інтенсивність ферментативного фібринолізу зростала через 1 год. і надалі залишалася більшою за контрольні показники: через 60хв. - на 30,3%, через 120хв. - на 81,0%, через 120хв. на 67,2%. Водночас у старих щурів у зазначені періоди спостереження ФФА перевищувала вихідний рівень відповідно у 2,6, 3,7 і 5,6 разу. У старих тварин визначальна інтенсивність ензиматичного лізису фібрину в тканині тонкої кишки була на 24,8% меншою, ніж у статевозрілих щурів. Однак через 60, 120 і 180 хв. після поранення тонкої кишки у старих щурів ФФА її тканин виявилась суттєво більшою за таку у статевозрілих тварин - відповідно на 47,1, 54,0 і 150,0%. У статевозрілих щурів впродовж експерименту спостерігалась зміна структури сумарної фібринолітичної активності тканини тонкої кишки, що характеризувалось поступовим збільшенням частки ферментативного фібринолізу, особливо на 120-у і 180-у хв. експерименту. У старих тварин визначально переважав неферментативний фібриноліз, однак наприкінці експерименту частка ферментативної фібринолітичної активності в прилеглій до зони поранення тканині тонкої кишки була майже вдвічі більшою, ніж частка неензиматичного лізису фібрину. Результати дослідження підтверджують високий ступінь стандартизації поранення тонкої кишки, що зокрема дозволяє визначити різницю змін інтенсивності тканинного фібринолізу у статевозрілих і старих щурів. Відповідність критерію "новизна" даного способу забезпечує те, що на дрібних лабораторних тваринах (білі щури) виконується експериментальне поранення тонкої кишки. Відповідність критерію "суттєві відмінності" даного способу забезпечує те, що на відміну від відомих раніше способів поранення тонкої кишки 11138 експериментальне травмування виконується ножицями, шляхом розсічення поперек кишкової стінки при довжині розрізу 1 мм ВІДПОВІДНІСТЬ даної корисної моделі критерію "позитивний ефект" забезпечується результатами експериментальних досліджень, які засвідчують ефективність експериментального поранення тонкої кишки у дрібних лабораторних тварин (білі щури) Джерела інформації 1 Алекберадзе А В , Липницкий Е М Эндоскопический гемостаз у больных с кровоточащей пептической язвой // Хирургия - 2004 - №6 - С 63-65 2 Беляев А В Прогнозирование тяжести течения раннего послеоперационного периода у больных, оперированных по поводу желудочнокишечного кровотечения // Клин, хирургия - 1997 №5-6 - С 52-54 3 Бойко В В , Криворучко И А , Красивский С Л и др Лечебная тактика при толстокишечных кровотечениях опухолевого генеза // Хірургія України - 2003 - Т 8, №2 - С 63-64 4 Ефименко Н А , Лысенко М В , Асташов В Л Кровотечение из хронических гастродуоденаль ных язв современные взгляды и перспективы лечения // Хирургия - 2004 - №3 - С 56-60 5 Москвиченко И В , Грубник Ю В Эндолапароскопический гемостаз в лечении больных пожилого и старческого возраста с кровоточащими гастродуоденальными язвами // Хірургія України 2003 - Т 8 , №4 -С 214-215, 4 Москвиченко И В , Грубник Ю В , Грубник В В Применение локального эндоскопического гемостаза в комплексном лечении больных пожилого и старческого возраста с кровоточащими гастродуоденальными язвами // Хірургія України 2002 - Т 7, №3 - С 28-30 5 Патент України на винахід №30727А Спосіб визначення тканинної фібринолітичної активності / Б М Бондар, О Л Кухарчук, В М Магаляс - Бюл №8 -1999, Бюл №7-11 -2000 6 Харченко В П , Синев Ю В , Наседкин Г К Эндоскопический радиоволновой гемостаз в комплексном лечении гастродуоденальных язв, осложненных кровотечением //Хирургия - 2003 - №10 - С 33-34 Таблиця Динаміка змін тканинного фібринолізу у щурів з пораненням тонкої кишки (x±Sx) Статевозрілі щури п=15 Старі щури п=15 СФА, мкг ФФА, мкг СФА, мкг НФА, мкг ФФА, мкг НФА, мкг азофібрину / азофібрину / азофібрину / азофібрину / азофібрину / азофібрину / 1 г тканини за 1г тканини за 1 г тканини за 1 г тканини за 1г тканини за 1г тканини за 1год 1год 1год 1год 1год 1год Періоди спостереження Контроль 14,80±0,90 7,91 ±0,49 6 89±0,43 Через ЗО хв після поранення 16,37±0,87 р>0,05 8,82±0 77 р>0,05 7,55±0,69 р>0,05 Через 60 хв після поранення 18,41±1,10 р0,05 8,98±0,б2 р