Спосіб оцінки біологічної активності екстрактів тканин

Спосіб оцінки біологічної активності екстрактів тканин, що включає визначення флуоресцентним методом показників ефективної концентрації альбуміну і загальної концентрації альбуміну при взаємодії стандартних реактивів з сироватковим альбуміном людини, який відрізняється тим, що використовують очищений знежирений комерційний препарат сироваткового альбуміну людини, який попередньо навантажують екстрактом тканини, що аналізується. Корисна модель відноситься до галузей біофізики, біохімії, медицини і може бути використано для оцінки біологічної активності екстрактів тканин людини і тварин методом флуоресцентної спектроскопії. Оцінка біологічної активності речовин може виконуватись за допомогою різноманітних засобів як на рівні цілого організму і його функціональних параметрів, так і на молекулярному рівні, зокрема, за взаємодією препарату, який тестується, з клітинами, субклітинними структурами або окремими білками. Такий підхід є справедливим, зокрема, при визначенні дії екстрактів тканин, які мають широкий спектр біологічної дії. Відомий спосіб визначення біологічної активності речовин за їх взаємодією з еритроцитами [1], який полягає в тому, що речовину, яку тестують, інкубують з препаратом еритроцитів, реєструють показники метаболізму еритроцитів, розраховують співвідношення отриманих показників, за якими визначають біологічну активність речовини. Однак структурні і функціональні властивості еритроцитів залежать від багатьох факторів і, в першу чергу, від стану донора, що надає можливість виконувати тільки якісну оцінку і не дозволяє стандартизувати вимірювання. Крім того, до недоліків даного способу відноситься те, що він передбачає визначення цілої низки показників (ступеня гемолізу еритроцитів, рівня і інтенсивності деградації малонового альдегіду, антиокислювальної активності), яке подовжує строки і трудомісткість вимірювань. Одним з підходів до визначення біологічної активності речовин на молекулярному рівні є визначення ефективності їх взаємодії з транспортними білками крові і, в першу чергу, з сироватковим альбуміном людини (САЛ), який здійснює зворотнє зв'язування біологічно активних речовин і їх транспортування до відповідних тканин і органів [2]. Відомий спосіб визначення біологічної активності речовин за їх взаємодією з САЛ, який грунтується на вимірюванні падіння інтенсивності триптофанової флуоресценції цього білка при титруванні його зростаючими концентраціями біологічно активної речовини [3]. Основним недоліком цього способу є те, що він не дозволяє коректно визначати параметри зв'язування з білком сумішей біологічно активних речовин, до яких відносяться екстракти тканин. До недоліків цього способу відноситься також досить велика тривалість визначення, спричинена необхідністю проведення титрування зразків. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб визначення біологічної активності речовин, який грунтується на визначенні загальної (ЗКА) і ефективної (ЕКА) концентрацій альбуміну флуоресцентним методом [4] з використанням стандартного набору реактивів (реактиви 1, 2 і 3) [5]. При цьому, відношення ЗКА/ЕКА не залежить від числа молекул альбуміну в пробі і характеризує тільки фізико-хімічні властивості молекули альбуміну, що змінились при зв'язуванні біологічно активної речовини. СО 00 о> 11183 Спосіб полягає в тому, що показники ЗКА і ЕКА визначають безпосередньо в сироватці або плазмі крові. Для цього до 2,0мл розбавленої сироватки (плазми) крові додають 0,025мл реактиву 2, перемішують і вимірюють інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЕКА). В ту ж пробу додають 0,025мл реактиву 3. Перемішують і вимірюють інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЗКА). Для кількісної характеристики ефективності зв'язування з САП речовин, що аналізуються, використовують показник Т (індекс токсичності) [6], який відображає ступінь заповнення альбумінових центрів речовиною: Т=(ЗКА/ЕКА)-1 (1) До основних недоліків цього способу можна віднести те, що він реалізується безпосередньо в сироватці або плазмі крові і в визначеннях використовують альбумін, який циркулює в кров'яному руслі, і який навіть у практично здорових донорів часто навантажений різними лігандами (триптофаном, жирними кислотами та ін. метаболітами), які грають роль додаткових факторів, що заважають визначенню. Тому при фізіологічному рН інтенсивність флуоресценції реактиву 2 з сироватки залежить не тільки від концентрації альбуміну, але й від фізико-хімічного стану альбумінової глобули, ковалентної і нековалентної модифікації амінокислотних залишків, конформації - тобто факторів, які змінюються в залежності від стану організму. В такому білку може бути знижена кількість центрів зв'язування лігандів, а також він може знаходитись в зміненому конформаційному стані, що також може впливати на результати вимірювань. Крім того, в сироватці (плазмі) крові існує ймовірність знаходження гетерогенних форм альбуміну. Відмічені фактори не дозволяють стандартизувати оцінку біологічної ефективності екстрактів тканин в сироватці (плазмі) крові і не дозволяє виключити вплив сторонніх лігандів та інших факторів, що знижують достовірність визначення. В основу корисної моделі поставлено задачу створення такого способу оцінки біологічної активності екстрактів тканин, який, завдяки виключенню впливу сторонніх лігандів, гетерогенності складу і конформаційного стану молекул альбуміну, а також уніфікації умов вимірювань дозволить підвищити достовірність оцінки і стандартизувати метод. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення біологічної активності речовин, який включає визначення флуоресцентним методом показників ЕКА і ЗКА при взаємодії стандартних реактивів з САП, згідно з корисною моделлю, використовують очищений знежирений комерційний препарат САЛ, який попередньо навантажують екстрактом тканини, що аналізується. Комерційний знежирений препарат САЛ є високоочищеним білком, який отримують з сироватки крові людини. Він майже не містить жирних кислот (вміст жирних кислот - не більше 0,005 %) [7] і характеризується однією смугою при електрофорезі в поліакріламідному гелі. В області значень рН 6 7,5 молекула САЛ стабільна і знаходиться в звичайній N-конформації [4]. Застосування для визначення біологічної активності екстрактів тканин знежиреного комерційного препарату САЛ замість альбуміну, який входить до складу сироватки донорів, дозволяє: - підвищити достовірність оцінки за рахунок виключення впливу на САЛ сторонніх лігандів, гетерогенності молекул САЛ і підвищення сорбційної ємності альбуміну по відношенню до препаратів, що тестуються; - стандартизувати метод шляхом використання комерційного препарату альбуміну і створення однакових умов вимірювань (температури, складу розчину, на якому готують альбумін), що надає можливість виконувати кількісні визначення. Спосіб здійснюють таким чином. В 2,0мл фізіологічного розчину (0,89% NaCI), забуференого 5мМ натрій-фосфатним буфером, рН 7,2, розчиняють 2-4мкМ знежиреного САЛ, ("Sigma", США). До того ж зразка додають 0,025мл екстракту тканини, який аналізується (з кінцевою концентрацією білків або нуклеотидів 0,01-10г/л), перемішують і додають 0,025мл реактиву 2. Вимірюють інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм в довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЕКА). Туди ж додають 0,025мл реактиву 3, після чого вимірюють інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЗКА). Вимірювання проводять при постійній температурі (20-22°С). За отриманими показниками ЗКА і ЕКА згідно з формулою (1) обчислюють величину Т (індекс токсичності), який відображає в даному випадку ступінь заповнення альбумінових центрів компонентами екстракту. Запропонований спосіб ілюструється наступними прикладами. Приклад 1 До 2,0мл розчину знежиреного САЛ (2мкМ) ("Sigma", США), приготованого на фізіологічному розчині, забуференому 5мМ натрій-фосфатним буфером, рН 7,2, додавали 0,025мл розмороженого кріоконсервованого екстракту печінки новонародженого поросяти (з концентрацією нуклеотидів 0,04г/л), після чого додавали 0,025мл реактиву 2, який входить до складу стандартного набору реактивів для визначення ЕКА і ЗКА. Перемішували і вимірювали інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЕКА). До тієї ж проби додавали 0,025мл реактиву 3, після чого перемішували і вимірювали інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЗКА). Згідно з формулою (1) визначали величину Т, яка дорівнювала 0,43. Приклад 2 До 2,0мл розчину знежиреного САЛ (2мкМ) ("Sigma", США), приготовленого як описано в прикладі 1, додавали 0,025мл розмороженого кріоконсервованого екстракту селезінки свині (з концентрацією нуклеотидів 0,046г/л), після чого додавали 0,025мл реактиву 2, який входить до складу стан 11183 дартного набору реактивів для визначення ЕКА і ЗКА Перемішували і вимірювали інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЗКА) До тієї ж проби додавали 0,025мл реактиву 3, після чого перемішували і вимірювали інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЗКА) Згідно З формулою (1) визначали величину Т, яка дорівнювала 0,24 Приклад З До 2,0мл розчину знежиреного САЛ (2мкМ) ("Sigma", США), приготовленому як в прикладі 1, додавали 0,025мл свіжого екстракту плаценти людини (з кінцевою концентрацією нуклеотидів 0,6г/л і білків 9,5г/л), після чого додавали 0,025мл реактиву 2, який входить до складу стандартного набору реактивів для визначення ЕКА і ЗКА Перемішували і вимірювали інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЗКА) В ту ж пробу додавали 0,025мл реактиву 3, після чого перемішували і вимірювали інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЗКА) Згідно З формулою (1) визначали величину Т, яка дорівнювала 0,82 Приклад 4 До 2,0мл розчину знежиреного САЛ ("Sigma", США), приготовленого як в прикладі 1, додавали 0,025мл автоклавованого при 125°С екстракту плаценти людини (з кінцевою концентрацією нуклеотидів 0,2г/л), після чого додавали 0,025мл реактиву 2, який входить до складу стандартного набору реактивів для визначення ЕКА і ЗКА Перемішували і вимірювали інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЗКА) До тієї ж проби додавали 0,025мл реактиву 3, після чого перемішували і вимірювали інтенсивність флуоресценції при довжині хвилі збудження Комп ютерна верстка Д Шеверун 420±20нм і довжині хвилі випромінювання 515±20нм (ЗКА) Згідно З формулою (1) визначали величину Т, яка дорівнювала 0,10 Як видно з прикладів, спосіб визначення біологічної активності екстрактів тканин, що заявляється, дозволяє оцінити біологічну активність різноманітних екстрактів тканин людини і тварин, як свіжих, так і тих, що були піддані високо- і низькотемпературній обробці, по їх взаємодії з альбуміном Спосіб може бути реалізований на стандартних спектрофлуориметрах або на аналізаторі АКЛ01 (Росія) І, таким чином, є повністю готовим до практичного застосування Джерела інформації 1 Пат РФ №2008680 G01 N33/48 Публ 1994 02 28 Способ определения биологической активности вещества 2 Соркина Д А , Залевская И Н Сіруктуріюфуккционадмше свойства белков Учеб пособие Киев Выща школа, 1990 - С 119-141 3 Seetharamappa J , Kamat В Р Spectroscopic studies on the mode of interaction of an anticancer drug with bovine serum albumin // Chem Pharm Bull (Tokyo) - 2004 Vol 52(9)-P 1053-1057 4 Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / Под ред Ю А Грызунова и ГЕДобрецова Книга 2 - Москва ГЭОТАР, 1998С 104-107 5 Инструкция по применению набора реактивов для определения показателей «эффективная концентрация альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке (плазме) крови человека флуоресцентным способом Научноисследовательский методический внедренческий центр «Зонд» -Москва, 2004 6 Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / Под ред Ю А Грызунова и Г Е Добрецова - Москва ИРИУС, 1994,- С 30 7 Biochemicals & Reagents for Life Science Research "Sigma"1", 2004 - P 111 Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності вул Урицького 45 м Київ, МСП 03680 Україна ДП "Український інститут промислової власності' вул Глазунова 1 м Київ-42, 01601