Спосіб гасіння власної флуоресценції білків

Спосіб гасіння власної флуоресценції білків, що включає титрування досліджуваного зразка розчином гасника, який відноситься до а,р- ненасичених амідів, вимірювання інтенсивності флуоресценції білка і визначення константи гасіння Штерна-Фольмера, який відрізняється тим, що як гасник використовують 2-МЄТИЛ-5нітро-ізохінолон-1(2Н) в початковій концентрації Корисна модель належить до галузі біофізики і може бути використаний для дослідження конформаційних змін білків методом флуоресцентної спектроскопії. Для вирішення низки біофізичних задач, пов'язаних з вивченням за допомогою методу флуоресцентної спектроскопії змін конформаційного стану біомакромолекул, які зазнали дії різноманітних фізико-хімічних факторів, використовуються не лише явище власної флуоресценції білків чи люмінесцентні барвники-зонди, але й ефективні гасії - речовини, які призводять до безвипромінювального розсіювання енергії електронного збудження. На ефекті гасіння власної флуоресценції біологічних макромолекул, зокрема, водорозчинних і мембранних білків, побудовано низку методик, які надають інформацію про зміни конформації білкових макромолекул під дією зовнішніх факторів [1]. Відомий спосіб гасіння власної флуоресценції білків за допомогою синглетного кисню, який гасить флуоресценцію майже всіх відомих флуорофорів [1]. Однак, при здійсненні цього способу виникає низка технічних і метрологічних труднощів, пов'язаних з експериментальними незручностями роботи з газами і необхідністю ізоляції зразків від оточуючої кисневої атмосфери [2]. Відомий спосіб гасіння власної флуоресценції білків з використанням йодиду калію [3]. Одним з недоліків цього способу є те, що «діючий початок» йодиду калію - аніон Г несе на собі негативний заряд, внаслідок чого він не проникає глибоко в білкову молекулу і здатний гасити флуоресценцію лише поверхневих ароматичних залишків білків (переважно за статичним механізмом - шляхом утворення комплексу, який не випромінює). Це не дозволяє вивчати за допомогою йодиду калію стан глибоко розташованих ділянок білкових глобул, а також інтегральних білків, які входять до складу біомембран. Недоліком також є необхідність роботи при високих концентраціях йодиду калію, внаслідок чого в розчині створюються високі значення іонної сили, при яких може початись денатурація білкових молекул. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб гасіння власної флуоресценції білків із використанням акриламіду [2]. Завдяки тому, що акриламід є нейтральною незарядженою молекулою, він здатний проникати всередину білкових молекул і гасити власну флуоресценцію білків за динамічним механізмом. Спосіб полягає в тому, що розчин білка, який досліджується, титрують невеликими порціями (по 5-Юмкл) концентрованого (зазвичай 3-1 ОМ) розчину акриламіду. Для кожної доданої концентрації на спектрофлуориметрі реєструють інтенсивність флуоресценції білка в максимумі і після закінчення титрування за отриманими даними будують графік Штерна-Фольмера, за нахилом якого судять про ефективність гасіння, а також обчислюють значення константи гасіння (Ksv) [2]. До недоліків цього способу можна віднести: - недостатню чутливість до конформаційного стану деяких ізольованих білків [4], білкових сумішей, а також білків, вбудованих в мембрани клітин [5]; (4-н5)хЮ~ 3 М. со 00 О) 11184 - високі концентрації (ЗМ і більше) розчину акриламіду, що використовують, які можуть порушувати конформаційний стан білків, які досліджуються [6], - високу токсичність акриламіду [7], яка вимагає використання спеціальних запобіжних засобів при роботі з ним і яка є джерелом небезпеки для стану здоров'я дослідника В основу корисної моделі поставлено задачу створення такого способу гасіння власної флуоресценції білків, в якому заміна гасника дозволить підвищити чутливість методу, зменшити токсичний вплив, який чинить гасник на об'єкт дослідження і на дослідника Поставлена задача вирішується тим, що в способі гасіння власної флуоресценції білків, який включає титрування зразка, що досліджується, розчином гасника, який відноситься до а,(3ненасичених амідів, вимірювання інтенсивності флуоресценції білка і визначення константи гасіння Штерна-Фольмера (Ksv), згідно з корисною моделлю, як гасника використовують спиртовий розчин 2-метил-5-нітро-ізохінолон-1(2Н) (надалі - ІКС5) з початковою концентрацією (4-5)х10~ 3 М Органічна сполука ІКС-5 являє собою Nметильований нітрозаміщений циклічний амід вигляду ІКС-5 не має власної флуоресценції в УФобласті в водних іспиртових розчинах, однак ефективно гасить флуоресценцію білків, які знаходяться у водному розчині і в складі біологічних мембран Спектр поглинення ІКС-5 розташований в діапазоні випромінювання основних білкових флуорофорів - амінокислотних залишків тирозша і триптофана, тобто, ПСС-5 здатний до безвипромінювальної дезактивації їх збуджених станів за механізмом синглет-синглетного індуктивнорезонансного переносу енергії Крім того, наявність в молекулі ІКС-5 сильного електроноакцепторного замісника,-нітрогрупи, зумовлює можливість гасіння збуджених станів молекул, які знаходяться в безпосередній близькості від неї органічних флуорофорів за механізмом фотопереносу електрона Завдяки своїй ХІМІЧНІЙ структурі ІКС-5 легко проникає в бюполімер і забезпечує ефективне гасіння власної флуоресценції ароматичних залишків білка за механізмами індуктивнорезонансного переносу енергії і переносу електрона ІКС-5 є малотоксичною речовиною і робота з ним не потребує спеціальних застережливих мір Застосування ІКС-5 для гасіння власної флуоресценції водорозчинних і мембранозвязаних білків дозволяє - підвищити чутливість методу до конформаційних змін білків, які знаходяться в розчині або тих, що входять до складу бюмембран, - знизити пошкоджуючу дію на об'єкт дослідження завдяки зниженню КІЛЬКОСТІ гасника, який вводиться в біооб'єкт, що досліджується, - зменшити можливість токсичного впливу гасника на дослідника Спосіб здійснюють наступним чином Водний розчин білка, який досліджується, (суспензію мембран або цілих клітин) обємом Змл титрують порціями (по 5мкл) спиртового розчину ІКС-5 з початковою концентрацією (4-5)х10 3 М Для кожної доданої концентрації ІКС-5 на спектрофлуориметрі реєструють інтенсивність флуоресценції білка в максимумі і після закінчення титрування за отриманими даними будують графік Штерна-Фольмера, за нахилом якого судять про ефективність гасіння, а також обчислюють значення константи гасіння (Ksv) згідно з формулою [8] Fo/F=1+KSV[Q], (1) де Fo і F - інтенсивності флуоресценції у відсутність і при наявності гасника ВІДПОВІДНО, [Q] - концентрація гасника Спосіб гасіння, який запропоновано, ілюструють наступні приклади Приклад 1 (Гасіння флуоресценци БСА) Розчин бичачого сироваткового альбуміну (БСА) ("Sigma", США) об'ємом 3,0мл з концентрацією 4x10 М, приготовлений на 5мМ натрійфосфатному буфері, рН 7,4, титрували порціями по 5мкл розчином ІКС-5 з початковою концентрацією 4x10 3 М (розчиненим в 0,5мл спирту) Для порівняння титрування білка було проведено також порціями по 5мкл 10М акриламідом Гасіння флуоресценції водного розчину БСА спостерігали за падінням флуоресценції розчину БСА в максимумі його спектру на довжині хвилі 340нм і при використанні для збудження світла з довжиною хвилі (Лзб)=280нм при збільшенні концентрації ІКС-5 в розчині, який титрували, від 6,7x10 6 до 5,3x105М без змін форми і положення спектру Константу Штерна-Фольмера (Ksv) обчислювали згідно з рівнянням (1) Обчислені значення Ksv для гасія і акриламіду склали 1,0х103М 1 і 22,7М 1 , ВІДПОВІДНО Приклад 2 (Гасіння флуоресценції БСА, який зазнав денатуруючого впливу мочевини) З використанням ІКС-5 титрували два водних розчини БСА контрольний і дослідний (денатурований 4М мочевиною) як описано в прикладі 1 Контрольний розчин готували аналогічно описаному в прикладі 1 До дослідного розчину додавали мочевину в кінцевій концентрації 4 М При цьому флуоресценція контрольного і дослідного розчинів БСА гасилась, що можна було спостерігати за падінням інтенсивності обох зразків на довжині хвилі 340нм (Л3б=280нм) із зростанням концентрації ІКС-5 в розчинах, які титрували, від 6,7x10 6 до 5,3x105М Ефективність гасіння визначали згідно з рівнянням (1) шляхом обчислювання константи гасіння флуоресценції (Ksv) Обчислені значення Ksv для гасіння ІКС-5 контрольного і денатурованого мочевиною зразків САБ становили 1,0х103М1 і 1,4х103М 1 , ВІДПОВІДНО Приклад 3 (Гасіння флуоресценції білків плазми крові Вплив заморожування) Плазму відокремлювали від еритроцитів цільної крові шляхом центрифугування при ЗОООд впродовж 5хв (контроль) Дослідний зразок плаз 11184 ми піддавали швидкому зануренню в рідкий азот (-196°С) з наступним відігрівом при перемішуванні на водяній бані (40°С) В обох випадках плазму крові розводили в 40 разів 5мМ натрійфосфатним буфером, рН 7,4 З використанням ІКС-5 титрували два зразка плазми крові донора контрольний і дослідний Гасіння обох розчинів здійснювали ІКС-5 як описано в прикладі 1 При цьому флуоресценція контрольного і опитного розчинів плазми крові гасилась, що спостерігали за падінням флуоресценції плазми при довжині хвилі 332-345 нм (Л3б=280нм) з підвищенням концентрації ІКС-5 в розчині, що титрували від 6,7x10 6 до 5,3x10 5 М Ефективність гасника визначали згідно з рівнянням (1) Обчислені значення Ksv для гасіння контрольного і дослідного зразків за допомогою ІКС-5 становили 2,4хЮ 2 М 1 і 3,1хЮ2М 1 , ВІДПОВІДНО Приклад 4 (Гасіння флуоресценції білків еритроцитів цільної крові в присутності солі) Еритроцити відмивали від плазми фізіологічним розчином триразовим центрифугуванням (Юхв , ЗОООд) В ДОСЛІДНИЙ зразок додавали сіль (КС1) до кінцевої концентрації 4М В обох випадках еритроцити розводили в 1000 разів 5мМ натрій-фосфатним буфером, рН 7,4 За допомогою спиртового розчину ІКС-5, який мав концентрацію 4,9x10 3 М, титрували два зразка суспензії еритроцитів донора, - контрольний і дослідний, як описано в прикладі 1 При цьому флуоресценція обох зразків гасилась, що можна було бачити з падіння інтенсивності флуоресценції еритроцитів на довжині хвилі 325-ЗЗОнм (Л3б=280нм) із збільшенням концентрації ІКС-5 в розчині, який титрували, від 8,2x10 6 до 6,5x105М Обчислені згідно з рівнянням (1) значення Ksv для гасіння ІКС-5 контрольного і дослідного зразків еритроцитів донора становили 1,9х102М1 і З прикладів видно, що значення констант гасіння (Ksv) для ІКС-5 перевищують аналогічні показники для акриламіду майже в 102 разів Це свідчить про більш високу ефективність нового гасника при його значно меншій КІЛЬКОСТІ, ЩО забезпечує меншу пошкоджуючу дію на об'єкт дослідження Спосіб, що заявляється, не потребує додаткових спеціальних пристроїв, може бути використаний на стандартних спектрофлуоріметрах і, таким чином, є повністю готовим до практичного застосування Джерела інформації 1 Kautsky H Quenching of luminescence by oxygen // Trans Faraday Soc-1939 -V 35 -P 216 2 Лакович Дж Основы флуоресцентной спектроскопии - М Мир, 1986 -С 263-273 3 Eftink М R, Chiron С А , Fluorescence quenching of indole and model micelle systems // J Phys Chem - 1976 - V 80 - P 486 4 Jullien M , Garel J R , Merola F , Brochon J С Quenching by acrylamide and temperature of a fluorescent probe attached to the active site of nbonuclease // Eur Biophys J - 1986- Vol 13, №3- P131137 5 Caputo G A , London E Using a novel dual fluorescence quenching assay for measurement of tryptophan depth within hpid bilayers to determine hydrophobic alpha-helix locations within membranes // Biochemistry - 2003 - Vol 42, №11 -P 3265-3274 6 Dobryszycki P, Rymarczuk M , Bulaj G , Kochman M Effect of acrylamide on aldolase structure I Induction of intermediate states // Biochim Biophys Acta -1999 - Vol 1431, №2 - P 338-350 7 Досон P , Эллиот Д , Эллиот У , Джонс К Справочник биохимика М Мир, 1991 -С 376 8 Лакович Дж Основы флуоресцентной спектроскопии - М Мир, 1986 -С 56 1,5х102М 1 , ВІДПОВІДНО Комп ютерна верстка Д Шеверун Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності вул Урицького 45 м Київ МСП 03680 Україна ДП Український інститут промислової власності вул Глазунова 1,м Київ-42, 01601