Спосіб визначення ступеня лізосомальної активності біологічної тканини

Винахід відноситься до медицини, зокрема до визначення, вимірювання, або реєстрації з діагностичною ціллю та може бути використаним в гістології, патологічній анатомії та патофізіології. Відомий спосіб визначення лізосомальної активності, що включає проведення гістохімічної реакції на кислу фосфатазу, у відповідності з яким, тканину обробляють азотнокислим свинцем та оцінюють присутність лізосом в клітинах, яка визначається наявністю в останніх осаду свинця [1]. Причиною, що стримує досягнення очікуваного технічного результату, є низька інформативність та тривалість методу. Осад серністого свинця, що виникає після проведення реакції, дозволяє охарактеризувати локалізацію лізосом в клітинах, але не дає уявлення про кількість клітин та диференціацію їх на ті, що містять велику кількість лізосомальних елементів та ті, що помірно насичені лізосомами. Тому міркування про лізосомальну активність такої тканини при використанні даного метода не є правомірним. Випадіння осаду свинця в тканині робить неможливим паралельне дослідження інших її гістологічних структур. Все це робить недостатньо інформативним вищезазначений метод визначення лізосомальної активності. Крім того для відтворення даного способу необхідний тривалий час (24 години і вище) для обробки біологічного матеріалу, що не дає можливості швидко отримувати результат. До основи винаходу поставлено задачу розробити такий спосіб визначення ступеня лізосомальної активності біологічної тканини, який шляхом використання удосконаленої гістохімічної реакції та оціночної шкали активності лізосом скорочує тривалість обробки біологічної тканини, робить процес отримання кінцевого результату більш швидким та підвищує його інформативність при використанні. Означений вище технічний результат досягається тим, що у відомому способі, що включає проведення гістохімічної реакції на кислу фосфатазу, який відрізняється тим, що, додатково, під час проведення гістохімічної реакції, біологічну тканину обробляють a - нафтилфосф атом натрію та сіллю червоного міцного RC, визначають число крапок окулярної вставки, що потрапили на гістохімічнопозитивну ділянку, відносний об'єм гістохімічнопозитивної ділянки тканини за допомогою крапкової окулярної вставки, підраховують загальний відносний об'єм всіх гістохімічнопозитивних ділянок та визначають ступінь лізосомальної активності біологічної V тканини як низький, якщо nз складає до 5%, від 6% до 8% - як середній і більше 8% - як високий, за умови, що V nз = SVnx при цьому P V nx = i ´ 100% Pt де Pt Pi - число крапок окулярної вставки, що потрапили на гістохімічнопозитивну ділянку; - загальна кількість крапок окулярної вставки, яка є постійною. Причинно-наслідковий зв'язок сукупності істотних ознак з означеним вище технічним результатом полягає в тому, що обробка гістопрепарату a - нафтилфосф атом натрію та сіллю червоного міцного RC дозволяє чітко розрізнити не тільки клітини, що містять лізосоми (їх можливо навіть порахувати), але і означити структурні деталі цих клітин та її ядра. Це дає можливість провести комплексне гістологічне дослідження зразку, а також визначити ступінь лізосомальної активності біологічної тканини, що робить спосіб багатоінформативним. Поряд з цим термін гістохімічної обробки тканини при даному методі дорівнює всього декілька годин, що робить його зручним при необхідності швидкого отримання кінцевого результату. Морфологічним критерієм наявності в клітині великої кількості лізосом є забарвлення після проведення гістохімічної реакції в пурпурово-червоний колір ділянок, що мають активність кислої фосфатази - лізосомного маркерного фермента. Приведені показники оціночної шкали, за якою оцінюють лізосомальну активність біологічної тканини, є оптимальними, що доведено багаточисленними дослідженнями. Для доведення можливості відтворення способу з отриманням вищезазначеного технічного результату, проведено дослідження на 25 зразках тканини. Результати проведених досліджень біологічної тканини дозволили встановити, що гістохімічна реакція на кислу фосфатазу в комбінації з азобарвниками (червоний міцний RC) виявляє клітини або групи клітин з великою кількістю лізосом, що характерно для специфічних тканин, або для патологічних процесів, таких як: апоптоз, некроз та інших. Відтворений спосіб дозволяє швидко діагностувати наявність „хвороби" або „передхвороби" тканини, якщо велика кількість лізосом в клітинах для неї не є характерною. Це досягається завдяки невеликому терміну проведення реакції та аналізу результату з визначенням того чи іншого ступеня лізосомальної активності, що знижує тривалість та підвищує інформативність заявляемого методу у порівнянні з прототипом. Отже, сукупність відокремлюючих ознак винаходу, що заявляється, є істотною, бо має причинно-наслідковий зв'язок з підвищенням інформативності та зменшенням тривалості обробки біологічної тканини. Відомості, що підтверджують можливість здійснення способу визначення лізосомальної активності біологічної тканини, що заявляється, полягають в наступному. Для здійснення способу визначення ступеню лізосомальної активності біологічної тканини, необхідне таке обладнання і матеріали як: набір реактивів, заморожуючий мікротом, світловий мікроскоп, крапкова окулярна вставка. Фіксування, заливку матеріалу та проведення гістохімічної реакції виконують за традиційними схемами [2]. Спосіб визначення лізосомальної активності біологічної тканини виконують наступним чином. Відразу після забіру біоптату зразок тканини розміщують в охолодженому до 4°С 10% нейтральному формаліні на 10-12годин. На заморожуючому мікротомі роблять зрізи 10-15мкм завтовшки. Переносять при кімнатній температурі в розчин, що містить 10-20мг a - нафтилфосф ата натрію в 20мл 0,1М веронал-ацетатного буфера при рН5,0; добавляють 20мг солі червоного міцного RC (азобарвник). Інкубують 1-60 хвилин в (залежності від тканини). Промивають під проточною водою 2 хвилини. Добарвлюють гематоксиліном Маєра 4-6 хвилин, знову промивають проточною водою 30 хвилин та переносять в гліцериновий гель. Після цього оцінюють в світловому мікроскопі. При проведенні візуального обстеження біоптату за допомогою світлового мікроскопа визначають гістохімічнопозитивні ділянки тканини, які мають пурпурово-червоний колір. За допомогою крапкової окулярної вставки [3] та формул підраховують загальний відносний об'єм таких ділянок. Якщо він складає до 5% -оцінюють ступінь лізосомальної активності як низький, від 6% до 8% - як середній, вище 8% - як високий. У відповідності з винаходом для визначення ступеню лізосомальної активності біологічної тканини необхідно оцінити дві групи тварин: 1 група - дорослі щури зі здоровим серцем; 2 група - дорослі щури з експериментальною ішемією міокарда. Приклад 1. Група щурів зі здоровим серцем. Забір біоптату зроблений у 2 тварин. Відразу після забіру біоптату зразки тканини розмістили в охолодженому до 4°С 10% нейтральному формаліні на 10 годин. На заморожуючому мікротомі зробили зрізи 10мкм завтовшки. Перенесли при кімнатній температурі в розчин, що містив 15мг a - нафтилфосф ата натрію в 20мл 0,1М веронал-ацетатного буфера при рН5,0; добавили 20мг солі червоного міцного RC. Інкубували 35 хвилин. Промили під проточною водою 2 хвилини. Добарвили гематоксиліном Маєра 4-6 хвилин, знову промили проточною водою (30 хвилин) та перенесли в гліцериновий гель. Після цього оцінили в світловому мікроскопі. При проведенні візуального обстеження біоптатів за допомогою світлового мікроскопа визначили гістохімічнопозитивні ділянки міокарда, які мали пурпурово-червоний колір. За допомогою крапкової окулярної вставки та формул підрахували загальний відносний об'єм цих ділянок: 1 щур: V vз=0,25%+0,31%=0,56% - ступінь лізосомальної активності оцінюєм як низький (до 5%). 2-й щур: V vз=1,01+0,20%+0,83%=2,04% - ступінь лізосомальної активності оцінюєм як низький (до 5%). Приклад 2. Група щурів з експериментальною ішемією міокарда. Підготовку матеріалу на всіх етапах проводили за вищезазначеною методикою. 1 щур: V vз:=3,25%+2,31%+4,12=9,68% - ступінь лізосомальної активності оцінюєм як високий (більше 8%). 2-й щур: Vvз=2,20%+4,83%+3,17%+l,12%=ll,32% - ступінь лізосомальної активності оцінюєм як високий (більше 8%). Таким чином, після проведення експериментального випробування запропонованого способу визначення ступеню лізосомальної активності біологічної тканини заявником встановлено, що заявлений спосіб може бути широко використаний у роботі патологоанатомічних відділень та дослідницьких морфологічних і патофізіологічних лабораторій для заявляемого рішення задачі у тому вигляді, як воно охарактеризоване у незалежному пункті формули. Підтверджена можливість його здійснення за допомогою вказаних у заявці, або відомих до дати пріоритету, діагностичних приладів і середовищ. Спосіб, що втілює заявляємий винахід, при здійсненні забезпечує досягнення позитивного результату, а саме: визначення ступеню лізосомальної активності біологічної тканини за коротший термін та з підвищеною інформативністю по відношенню до прототипу. Отже, розроблений об'єкт відповідає умовам «промислова придатність», «новизна», «винахідницький рівень» і може бути кваліфікований винаходом України. Джерела інформації: 1. Пирс Э. Метод выявления кислой фосфатазы фосфорнокислым свинцом (по Гомори) // Гистохимия. - М.: Иностранная литература, 1956. -С.407. 2. Пирс Э. Модифицированный метод метод выявления кислой фосфатазы сочетанием в азокрасители (по Гроггу и Пирсу) // Гистохимия. - М.: Иностранная литература, 1956. -С.408. 3. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина, 1990. -384с .