Спосіб приготування тест-систем для діагностики гарячки західного нілу методом імунофлюоресценції

Реферат: Спосіб приготування тест-систем для лабораторної діагностики гарячки Західного Нілу методом імунофлюоресценції включає репродукування штамів вірусу Західного Нілу в перещеплюваній культурі клітин лінії СНЕВ, збір вірусовмісних клітин та нанесення їх на предметні скельця, фіксацію клітин ацетоном і обробку їх ультрафіолетовим опроміненням. Як діагностикум використовуються антигени, приготовані із перещеплюваних клітин лінії СНЕВ, інфікованих циркулюючими в Україні штамами вірусу Західного Нілу, завдяки чому мають більшу чутливість, специфічність та достовірність результатів порівняно з аналогічними тест-системами, в яких застосовуються діагностикуми, приготовані на основі штамів даного вірусу, виділених в інших регіонах світу. UA 115795 U (12) UA 115795 U UA 115795 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме створення діагностичних препаратів, і призначена для проведення специфічної лабораторної діагностики гарячки Західного Нілу (ЗН). Лабораторна діагностика гарячки Західного Нілу проводиться із застосуванням певних імуно-серологічних реакцій, у тому числі з використанням методу імунофлюоресценції. Даний метод ґрунтується на специфічній імунохімічній взаємодії антигену вірусу ЗН з відповідним антитілом до нього. Візуалізація цих антиарбовірусних антитіл, зв'язаних з антигеном, здійснюється з допомогою антивидових антитіл, мічених флуоресціюючими барвниками, серед яких найчастіше використовують флюоресцеїнізотіоціанат (ФІТЦ), що зумовлює світіння зеленого кольору в ультрафіолетовому спектрі люмінесцентного мікроскопа [1-2]. На основі вказаного методу для виявлення антитіл до вірусу ЗН широко застосовують реакцію непрямої імунофлюоресценції (РНІФ), що характеризується високою специфічністю та чутливістю [1-2]. Постановка даної реакції включає використання відповідних тест-систем, які, головним чином, зводяться до застосування специфічного вірусного антигену (діагностикуму), приготовленого на основі збудників, що викликають дане захворювання. Задачею корисної моделі є розробка способу приготування тест-систем для діагностики гарячки ЗН в реакції непрямої імунофлюоресценції із використанням штаму збудника, ізольованого в Україні, що за своєю специфічністю та чутливістю переважали б результативність аналогічних методів із застосуванням препаратів, виготовлених із еталонних штамів, виділених в інших країнах світу (Єгипті, РФ, США). Поставлена задача вирішується шляхом здійснення певної технології, у якій як діагностикум використовуються антигени, приготовані із перещеплюваних клітин лінії СНЕВ, інфікованих штамами вірусу ЗН. Пропонований спосіб включає репродукування штамів вірусу в перещеплюваній культурі клітин лінії СНЕВ, збір вірусовмісних клітин та нанесення їх на предметні скельця, фіксацію клітин ацетоном і обробку їх ультрафіолетовим опроміненням. Користуючись камерою Горяєва, визначають густину клітин і доводять її до концентрації 750000 кл/мл. Інфіковані вірусом ЗН клітини змішують у тому ж об'ємі і концентрації з нормальними (контрольними) клітинами, проводячи безперервне помішування. Отримана суміш клітин являє собою маточний матеріал для приготування діагностикумів. На чисто вимиті, знежирені у суміші Нікіфорова і висушені предметні скельця мікропіпеткою наносять по 6 краплин у 2 ряди маточного матеріалу. Предметним скельцям із маточним матеріалом ("слайдам"), дають висохнути при кімнатній температурі під витяжною шафою упродовж 3 годин. Фіксують "слайди" в охолодженому при температурі -20 °C хімічно чистому ацетоні 20 хв. і знову висушують у витяжній шафі на фільтрувальному папері до повного висихання. В результаті цієї фіксації відбувається ще й інактивація вірусу. Для повного знезараження "слайди" додатково обробляють ультрафіолетовим опроміненням упродовж 3 годин. Приготовані діагностикуми контролюють на специфічність та активність, після чого вони готові для використання. Для тривалого використання "слайди" обгортають алюмінієвою фольгою і в картонній коробці зберігають при температурі -80 °C. Отримані описаним способом тест-системи з антигенами до штамів вірусу ЗН, ізольованих в Україні (N 1, N 2), та еталонного штаму Eg-101 використовували в РНІФ для порівняльного титрування сироваток крові 48 гарячкових хворих з підозрою на гарячку ЗН. Результати проведених досліджень зведено у таблицю. 45 Таблиця Результати титрування сироваток крові гарячкових хворих з підозрою на гарячку Західного Нілу в РШФ з використанням тест-систем до різних штамів вірусу Західного Нілу Сироватки крові Число серопозитивних проб і титри антитіл до антигенів вірусу Західного Нілу: штам N 1 штам N 2 штам Eg-101 Хворих з Абс Абс Абс X X X підозрою на М±m М±m М±m % % % гарячку Західного 6 7 4 Нілу (48 проб) 33,7±2,5 39,3±2,7 20,2±2,3 12,5 14,6 8,3 Примітки. 1. N 1, N 2 - штами вірусу ЗН, ізольовані в Україні; 2. Eg-101 - еталонний штам; 3. X - середньогеометрична величина обернених значень титрів антитіл. 1 UA 115795 U 5 10 15 20 Із даних таблиці 1 видно, що при проведенні лабораторної діагностики гарячки Західного Нілу у вищезгаданих гарячкових хворих тест-системи приготовані із штамів вірусу ЗН, ізольованих в Україні, виявилися значно чутливішими і специфічнішими, ніж аналогічний діагностичний препарат, отриманий на основі еталонного штаму. Це виявляється у вищому на 4,2-6,3 відсотку кількості серопозитивних осіб до антигенів вірусу ЗН (12,5-14,6 % проти 8,3 %) і у вищих показниках титрів специфічних антитіл (1:33,7-1:39,3 проти 1:20,2). Таким чином, запропонований спосіб приготування тест-систем для лабораторної діагностики гарячки Західного Нілу методом імунофлюоресценції з використанням штамів вірусу Західного Нілу, що циркулюють в Україні, дає можливість отримати діагностичні препарати з вищим на 6,3 % діагностичним ефектом порівняно з аналогічним діагностикумом, приготовленим із прототипного (еталонного) штаму вірусу ЗН, що не циркулює в Україні. Впровадження даних тест-систем у вітчизняне виробництво і використання їх в лікувальнопрофілактичних та діагностичних закладах системи охорони здоров'я суттєво підвищить достовірність діагностики захворювань гарячкою Західного Нілу в Україні, а, отже, і ефективність лікування таких хворих. Джерела інформації: 1. Арбовирусы (методы лабораторных и полевых исследований). Под ред. С.Я. Гайдамович. - М.: Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР, 1986. - С. 113-119. 2. Посібник з медичної вірусології / В.М. Гирін, В.Г. Порохницький, С.Г. Вороненко [та ін.]. К.: Здоров'я, 1995. - 368 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб приготування тест-систем для лабораторної діагностики гарячки Західного Нілу методом імунофлюоресценції, що включає репродукування штамів вірусу Західного Нілу в перещеплюваній культурі клітин лінії СНЕВ, збір вірусовмісних клітин та нанесення їх на предметні скельця, фіксацію клітин ацетоном і обробку їх ультрафіолетовим опроміненням, який відрізняється тим, що як діагностикум використовуються антигени, приготовані із перещеплюваних клітин лінії СНЕВ, інфікованих циркулюючими в Україні штамами вірусу Західного Нілу, завдяки чому мають більшу чутливість, специфічність та достовірність результатів порівняно з аналогічними тест-системами, в яких застосовуються діагностикуми, приготовані на основі штамів даного вірусу, виділених в інших регіонах світу. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2