Спосіб приготування тест-систем для діагностики кліщового вірусного енцефаліту методом імунофлюоресценції

Реферат: Спосіб приготування тест-систем для діагностики кліщового вірусного енцефаліту методом імунофлюоресценції включає репродукування штамів вірусу в перещеплюваній культурі клітин лінії СНЕВ, збір вірусовмісних клітин та нанесення їх на предметні скельця, фіксацію клітин ацетоном і обробку їх ультрафіолетовим опроміненням. При цьому як діагностикум використовують антигени, приготовані із перещеплюваних клітин лінії СНЕВ, інфікованих циркулюючими в Україні штамами вірусу кліщового енцефаліту. UA 97645 U (12) UA 97645 U UA 97645 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до створення діагностичних препаратів, і призначена для проведення специфічної лабораторної діагностики кліщового вірусного енцефаліту (КВЕ). Лабораторна діагностика кліщового вірусного енцефаліту проводиться із застосуванням певних імуно-серологічних реакцій, в тому числі, з використанням методу імунофлюоресценції. Даний метод ґрунтується на специфічній імунохімічній взаємодії антигену вірусу кліщового енцефаліту (ВКЕ) з відповідним антитілом до нього. Візуалізація цих антиарбовірусних антитіл, зв'язаних з антигеном, здійснюється з допомогою антивидових антитіл, мічених флуоресціюючими барвниками, серед яких найчастіше використовують флюоресцеїнізотіоціанат (ФІТЦ), що зумовлює світіння зеленого кольору в ультрафіолетовому спектрі люмінесцентного мікроскопу [1-2]. На основі вказаного методу для виявлення антитіл до вірусу кліщового енцефаліту широко застосовують реакцію непрямої імунофлюоресценції (РНІФ), що характеризується високою специфічністю та чутливістю [1-2]. Постановка даної реакції передбачає використання відповідних тест-систем, які, головним чином, зводяться до застосування специфічного вірусного антигену (діагностикуму), приготовленого на основі збудників, що викликають дане захворювання. Задачею корисної моделі є розробка способу приготування тест-систем для діагностики кліщового вірусного енцефаліту в реакції непрямої імунофлюоресценції із використанням штаму збудника, ізольованого в Україні, що за своєю специфічністю та чутливістю переважали б результативність аналогічних методів із застосуванням препаратів, виготовлених із еталонних "сибірських" та "західноєвропейських" штамів. Поставлену задачу вирішують шляхом здійснення певної технології, у якій як діагностикум використовують антигени, приготовані із перещеплюваних клітин лінії СНЕВ, інфікованих штамами вірусу кліщового енцефаліту. Пропонований спосіб передбачає репродукування штамів вірусу в перещеплюваній культурі клітин лінії СНЕВ, збір вірусовмісних клітин та нанесення їх на предметні скельця, фіксацію клітин ацетоном і обробку їх ультрафіолетовим опроміненням. Користуючись камерою Горяєва визначають густину клітин і доводять її до концентрації 750000 кл/мл. Інфіковані штамами ВКЕ клітини змішують у тому ж об'ємі і концентрації з нормальними, контрольними клітинами, проводячи безперервне помішування. Отримана суміш клітин являє собою маточний матеріал для приготування діагностикумів. На чисто вимиті, знежирені у суміші Нікіфорова і висушені предметні скельця мікропіпеткою наносять по 6 краплин у 2 ряди маточного матеріалу. Предметним скельцям із маточним матеріалом ("слайдам") дають підсохнути при кімнатній температурі під витяжною шафою впродовж 3 годин. Фіксують "слайди" в охолодженому при температурі -20 °C хімічно чистому ацетоні 20 хв. і знову висушують під витяжною шафою на фільтрувальному папері до повного висихання. В результаті цієї фіксації відбувається ще й інактивація вірусу. Для повного знезараження "слайди" додатково обробляють ультрафіолетовим опроміненням впродовж 3 годин. Приготовані діагностикуми контролюють на специфічність та активність, після чого вони готові для використання. Для тривалого використання "слайди" обгортають алюмінієвою фольгою і в картонній коробці зберігають при температурі -80 °C не більше 2-х років. Отримані описаним способом тест-системи з антигенами до штамів ВКЕ, ізольованих в Україні (N1, N2) та еталонних штамів (N3, N4) використовували в РНІФ для порівняльного титрування сироваток крові 87 гарячкових хворих з підозрою на кліщовий вірусний енцефаліт. Результати проведених досліджень зведено у таблицю 1. 1 UA 97645 U Таблиця 1 Результати титрування сироваток крові гарячкових хворих з підозрою на кліщовий вірусний енцефаліт в РНІФ з використанням тест-систем до різних штамів вірусу кліщового енцефаліту Сироватки Число серопозитивних проб і титри антитіл до антигенів вірусу кліщового крові енцефаліту: Хворих з N1 N2 N3 N4 підозрою на Абс Абс Абс Абс X X X X кліщовий М±m М±m М±m М±m % % % % вірусний 13 15 7 8 енцефаліт (87 36,9±2,7 40,2±2,8 22,3±2,4 25,8±2,5 14,9 17,2 8,0 9,2 проб) Примітка: N 1, N 2 - штами ВКЕ, ізольовані в Україні; N 3, N 4 - еталонні штами ВКЕ; X - середньогеометрична величина обернених значень титрів антитіл. 5 10 15 20 Із даних таблиці 1 видно, що при проведенні лабораторної діагностики КВЕ у вищезгаданих гарячкових хворих тест-системи приготовані із штамів ВКЕ, ізольованих в Україні, виявилися значно чутливішими і специфічнішими, ніж аналогічні діагностичні препарати, отримані на основі еталонних штамів. Це виявляється у вищому на 5,7-9,2 відсотку кількості серопозитивних осіб до антигенів вірусу кліщового енцефаліту (14,9-17,2 % проти 8,0-9,2 %) і у вищих показниках титрів специфічних антитіл (1:36,9-1:40,2 проти 1:22,3-1:25,8). Таким чином, запропонований спосіб приготування тест-систем для лабораторної діагностики кліщового вірусного енцефаліту методом імунофлюоресценції з використанням штамів ВКЕ, циркулюючих в Україні, дає можливість отримати діагностичні препарати з вищим на 5,7-9,2 % діагностичним ефектом порівняно з аналогічними діагностикумами, приготовленими з прототипних (еталонних) штамів ВКЕ, що не циркулюють в Україні. Впровадження даних тест-систем у вітчизняне виробництво і використання їх в лікувальнопрофілактичних та діагностичних закладах системи охорони здоров'я значно підвищить достовірність діагностики захворювань кліщовим вірусним енцефалітом в Україні, а отже, і ефективність лікування таких хворих. Джерела інформації: 1. Арбовирусы (методы лабораторных и полевых исследований). Под ред. С.Я. Гайдамович. - М.: Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР, - 1986. - С. 113-119. 2. Посібник з медичної вірусології / В.М. Гирін, В.Г. Порохницький, С.Г. Вороненко [та ін.]. К.: Здоров'я. - 1995. - 368 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб приготування тест-систем для лабораторної діагностики кліщового вірусного енцефаліту методом імунофлюоресценції, що включає репродукування штамів вірусу в перещеплюваній культурі клітин лінії СНЕВ, збір вірусовмісних клітин та нанесення їх на предметні скельця, фіксацію клітин ацетоном і обробку їх ультрафіолетовим опроміненням, який відрізняється тим, що як діагностикум використовують антигени, приготовані із перещеплюваних клітин лінії СНЕВ, інфікованих циркулюючими в Україні штамами вірусу кліщового енцефаліту, завдяки чому мають більшу чутливість, специфічність та достовірність результатів порівняно з аналогічними тест-системами, в яких застосовуються діагностикуми, приготовані на основі інших (еталонних) штамів даного вірусу. 35 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2