Спосіб очищення ліпополісахаридних антигенів збудників бактеріальних та гельмінтозних захворювань ссавців для використання в імунодіагностиці

Реферат: Спосіб очищення ліпополісахаридних антигенів збудників бактеріальних та гельмінтозних захворювань ссавців для використання в імунодіагностиці, що включає екстракцію бактерій чи гельмінтів, відділення грубої ліпополісахаридної фракції з екстракту бактерій чи гельмінтів і очищення ліпополісахіридів від домішок. Відмивання бактеріальних клітин або гельмінтів проводять кілька разів у стерильному фосфатно-сольовому буфері pH 7,2. Виконують обробку ультразвуком та екстракцію бактеріальних клітин або гельмінтів у 50 мM тріс буфері pH 8,2 з додаванням 1 % Triton X100. Здійснюють центрифугування екстракту та діаліз проти дистильованої Н2О. Осаджують ліпополісахариди етиловим спиртом та ресуспендують осад у UA 116678 U (12) UA 116678 U карбонатбікарбонатному буфері з додаванням трихлороцтової центрифугування та діаліз надосаду проти дистильованої Н2О. кислоти. Проводять UA 116678 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної та гуманної медицини, та стосується технологій отримання антигенів для діагностичних тестів. Може бути використано в медицині, ветеринарії, біотехнології, отриманні бакпрепаратів, конструюванні діагностичних тест-систем, вакцин та імуномодуляторів Відомі різні способи отримання ліпополісахаридів (ЛПС): водно-фенольний спосіб, способи екстракції клітин водно-ефірною сумішшю і трихлороцтовою кислотою (Захарова И.М., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. - Киев: Наукова думка, 1982). Недоліками зазначених способів є невисокий ступінь очищення одержуваних ЛПС за рахунок присутності в препаратах домішок інших бактеріальних компонентів і тривалість процедур виділення. Найбільшу популярність має водно-фенольний спосіб отримання ЛПС (Westphal О., Luderitz О., Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol / Wasser // Z.Naturforsch. Teil B. - 1952. Vol.7. - P.148-155.), що включає обробку мікробної маси водно-фенольною сумішшю при 65 °C протягом 45 хв. Після охолодження суміш розділяють центрифугуванням. Водну фазу діалізу протягом 3-4 діб проти дистильованої води для видалення фенолу. ЛПС осаджують ультрацентрифугуванням при 100000 G, 15 °C протягом 3 год. Відомий також спосіб отримання бактеріальних ліпополісахаридів (Патент РФ № 2051969, МПК С12Р19 / 04, 1996), що включає культивування мікробної маси, відділення бактеріальних клітин, обробку їх водно-фенольною сумішшю, відділення водної фази центрифугуванням і очищення цільового продукту від домішок нуклеїнових кислот, при цьому водну фазу при 0-4 °C обробляють детергентом Тритон Х-114 в кінцевій концентрації 6 %, розділяють водну і детергентні фази при 37° С, збирають детергентну фазу, осаджують цільовий продукт ацетоном, відокремлюють осад центрифугуванням, промивають його ацетоном, розчиняють в дистильованій воді та ліофілізують. Основним недоліком способів екстракції ліпополісахаридів з використанням фенолу в різних варіантах є те, що вони належать до жорстких хімічних методів виділення ендотоксину і призводять до зміни вихідної молекулярної організації біополімера, порушуючи його нативну структуру і біологічні властивості. Крім того, фенол є летючим, агресивним, отруйним для людини і екологічно шкідливою речовиною. До щадних способів отримання ЛПС належать методи, основані на попередньому руйнуванні або лізису бактерій, з подальшою депротеїнізацією лізату комерційними протеазами, а також обробкою нуклеазами (Darveau R.P., Hancock R.T.W. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeruginosa and Salmonella thyphimurium strains // J.Bacteriol. - 1983. - Vol.155, № 2. - P.831-838.). Значним недоліком зазначених способів є багатоетапність і трудомісткість процедури, а також використання дорогих ферментів, що ускладнює процес отримання чистого ЛПС. Відомий спосіб отримання ліпополісахаридів (Патент РФ № 2483112, МПК C12P19/04, A61K39/02, A61K39/39, G01N33/53, 27.05.2013), що включає екстракцію ЛПС з бактеріальних клітин і його очищення протеолітичними ферментами, на етапі екстракції попередньо проводять водно-сольову обробку бактеріальних клітин з подальшим їх лізисом буфером, що містить 0,1 М Трис-НСl рН 8.0, 10 ммоль ЕДТА, 1 % Тритон Х-100, і деструкцією ультразвуком, потім неочищений екстракт ЛПС обробляють ферментним комплексом протеовібрину в концентрації 160 мкг/мл, інкубують при 37 °C, рН 7.8-8.0 протягом 18 год. з подальшим звільненням від нуклеїнових кислот шляхом підкислення крижаною оцтовою кислотою до рН 3.2-3.4 і їх осадження при 5000 g протягом 30 хв. Відомий спосіб отримання ліпополісахаридів (Патент РФ № 2237719, МПК C12P19/04, A61K39/02, A61K39/39, G01N33/53, 2004), що включає екстракцію ліпополісахаридів буферним розчином, що містить ЕДТА в кількості 0,01-0,05 ммоль на 1 г вологих клітин, 0,1 ммоль фенілметилсульфоніл хлорид і 1 % Тритон Х-100, відділенням отриманого екстракту від бактерій центрифугуванням і обробку ферментом протеїназою К. Недоліками найбільш близького аналогу можна вважати незначний вихід ліпополісахариду при екстракції бактеріальних клітин детергентом та використання дорогого ферменту протеїнази К для очищення екстракту ліпополісахариду. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу отримання антигенів збудників бактеріальних та гельмінтозних захворювань ссавців для використання в імунодіагностиці шляхом удосконалення очищення екстракту ліпополісахариду. Поставлена задача вирішується тим, що в способі очищення ліпополісахаридних антигенів збудників бактеріальних та гельмінтозних захворювань ссавців для використання в імунодіагностиці, проводять екстракцію бактерій чи гельмінтів, відділення грубої ліпополісахаридної фракції з екстракту бактерій чи гельмінтів і очищення ліпополісахіридів від 1 UA 116678 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 домішок, згідно з корисною моделлю, відмивання бактеріальних клітин або гельмінтів проводять кілька разів у стерильному фосфатно-сольовому буфері pH 7,2, обробку ультразвуком та екстракцію бактеріальних клітин або гельмінтів у 50 мM тріс буфері pH 8,2 з додаванням 1 % Triton X100, центрифугування екстракту та діаліз проти дистильованої Н2О, осадження ліпополісахаридів етиловим спиртом, ресуспендуванням осаду у карбонатбікарбонатному буфері, додавання трихлороцтової кислоти, центрифугування та діаліз надосаду проти дистильованої Н2О. Спосіб очищення ліпополісахаридних антигенів збудників бактеріальних та гельмінтозних захворювань ссавців для використання в імунодіагностиці здійснюють наступним чином, а саме спосіб включає наступні етапи: 1. Отримання екстракту бактерій або гельмінтів. Для отримання екстракту 5 г вологої біомаси бактерій, гельмінтів або їх личинок 10 разів відмивають у стерильному фосфатно-сольовому буфері pH7,2-7,4. Додають 25 мл 50 мM тріс буферу pH8,2 з 1 % Triton X100. Здійснюють дезінтеграцію ультразвуком на льодяній бані 20 разів по 1 хвилині з інтервалом в 1 хвилину при частоті 44 кГц і максимальній потужності. Екстракцію здійснюють протягом 24 годин при температурі 4 °C. Отриманий екстракт освітлюють центрифугуванням 30 хв при 18000 G та температурі 4 °C. 2. Виділення грубої фракції ліпополісахаридів з екстракту бактерій та гельмінтів. Освітлений екстракт бактерій чи гельмінтів діалізують проти 1000 об'ємів дистильованої Н2О, використовуючи мембрану з розміром пор 10000-15000Da. До екстракту додають охолоджений до 4 °C очищений етиловий спирт, закислений ацетатом натрію, у співвідношенні 1:3. Інкубують 24 години при 4 °C. Центрифугують 20 хв при 6000 G та температурі 4 °C. Осад ресуспендують у 20мл 0,05M карбонат-бікарбонатного буфера pH 9,6. 3. Очищення ліпополісахаридів. До 20 мл грубої фракції ліпополісахаридів додають 1 г трихлороцтової кислоти. Інкубують 20 хв при температурі 4 °C, помішуючи на магнітній мішалці. Центрифугують 20 хв при 6000 G та температурі 4 °C. Відбирають надосад та діалізують проти дистильованої H 2O. 4. Застосування ліпополісахаридних антигенів збудників бактеріальних та гельмінтозних захворювань ссавців. Препарат очищених ліпополісахаридних антигенів використовують, як антиген в діагностичних тест-системах, які базуються на принципі імуноферментного аналізу, імунохроматографічного аналізу, імуноблотингу і інших для виявлення антитіл до збудників бактеріальних та гельмінтозних захворювань у тварин та людини. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб очищення ліпополісахаридних антигенів збудників бактеріальних та гельмінтозних захворювань ссавців для використання в імунодіагностиці, що включає екстракцію бактерій чи гельмінтів, відділення грубої ліпополісахаридної фракції з екстракту бактерій чи гельмінтів і очищення ліпополісахіридів від домішок, який відрізняється тим, що відмивання бактеріальних клітин або гельмінтів проводять кілька разів у стерильному фосфатно-сольовому буфері pH 7,2, виконують обробку ультразвуком та екстракцію бактеріальних клітин або гельмінтів у 50 мM тріс буфері pH 8,2 з додаванням 1 % Triton X100, здійснюють центрифугування екстракту та діаліз проти дистильованої Н2О, потім осаджують ліпополісахариди етиловим спиртом та ресуспендують осад у карбонатбікарбонатному буфері з додаванням трихлороцтової кислоти, проводять центрифугування та діаліз надосаду проти дистильованої Н2О. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2