Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах

1. Спосіб отримання вакцини гепатиту В, яка містить очищений поверхневий антиген гепатиту В, що містить менш ніж 0,025мкг ртуті на 20мкг білку, та фармацевтично прийнятний ексципієнт, при якому цей антиген очищують у присутності відновного агента, що має вільну -SH груп у. 2. Спосіб за п. 1, де вакцина не містить консервант. 3. Спосіб за п. 2, де консервантом є тіомерсал. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, при якому антиген гепатиту адсорбують на гідроксиді алюмінію. 5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, при якому неочищений препарат антигену гепатиту В (а) піддають гель-проникаючій хроматографії; (б) піддають іонообмінній хроматографії; і (в) змішують з відновним агентом, що має вільну SH груп у. 6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, де відновним агентом є цистеїн, глутатіон, дитіотрейтол або b - меркаптоет анол . 7. Спосіб за п. 6, де відновним агентом є цистеїн. 8. Спосіб за п. 7, при якому цистеїн додають до кінцевої концентрації від 1 до 10мМ. 2 (19) 1 3 79735 4 21. Спосіб отримання поверхневого антигену гепатиту В, що придатний для використання у вакцині, при якому цей антиген очищають у присутності відновного агента, що має вільну -SH груп у, причому цей антиген очищують у присутності тіомерсалу перед обробкою відновним агентом. 22. Спосіб отримання антигену гепатиту В за п. 21, де очищений антигенний продукт містить менш ніж 0,025мкг ртуті на 20мкг білка. 23. Спосіб отримання антигену гепатиту В за п. 21 або 22, при якому неочищений препарат антигену гепатиту В: (а) піддають гель-проникаючій хроматографії; (б)) піддають іонообмінній хроматографії; і (в) змішують з відновним агентом, що має вільну SH груп у. 24. Спосіб отримання антигену гепатиту В за пп. 21-23, де відновним агентом є цистеїн, глутатіон, дитіотрейтол або b - меркаптоет анол . 25. Імуногенний антиген гепатиту В, що містить менш ніж 0,025мкг ртуті на 20мкг білка, отриманий шляхом очищення у присутності відновного агента, що має вільну -SH групу, і де цей антиген очищений у присутності тіомерсалу перед обробкою відновним агентом. 26. Вакцина, що містить антиген гепатиту В за п.25. 27. Спосіб лікування та/або профілактики вірусних інфекцій гепатиту В, при якому суб'єктові - людині або тварині, що страждає вірусною інфекцією гепатиту В або сприйнятливому до неї, вводять безпечну та ефективну кількість вакцини за будь-яким з пп. 13-19 та 26. Винахід стосується нового процесу виробництва вакцини гепатиту В для використання при лікуванні або профілактиці вірусних інфекцій гепатиту В (HBV). Крім того, він стосується HBV-вакцини, отриманої за допомогою цього нового процесу за винаходом. Хронічна вірусна інфекція гепатиту В (HBV), для якої існуюче в даний час лікування є обмеженим, складає глобальну проблему охорони здоров'я величезної важливості. Хронічні носії HBV, число яких оцінюють більше ніж 300 мільйонів в усьому світі, піддані ризикові розвитку хронічного активного гепатиту, цирозу і первинної злоякісної гепатоми. Багатьом вакцинам, які доступні в даний час, для запобігання розкладання необхідний консервант. Консервантом, який часто використовують є тіомерсал, що є ртутєвмісною сполукою. З приводу використання ртуті у вакцинах виникли деякі занепокоєння, хоча коментатори підкреслюють, що потенційної небезпеки тіомерсалвмісних вакцин, не слід перебільшувати [Offit; P.A. JAMA Vol.283; No: 16]. Проте був би корисним пошук нових і потенційно безпечних способів отримання вакцин, для того щоб замінити використання тіомерсалу в процесі виробництва. Таким чином, існує необхідність у розробці вакцин, що є вільними від тіомерсалу, зокрема, вакцин гепатиту В. За першим аспектом винаходу запропонований спосіб отримання антигену гепатиту В, що підходить для використання у вакцині, при якому цей антиген очищують у присутності відновного агента, що містить вільну -SH гр упу. За винаходом переважно запропонований спосіб отримання стабільного антигену гепатиту В без слідів тіомерсалу, при якому цей антиген очищують у присутності відновного агента, що містить вільну -SH груп у. Звичайно препаратом антигену є препарат без слідів тіомерсалу, коли тіомерсал не знайдений в очищеному антигенному продукті при використанні абсорбційної спектрофотометрії ртуті, як описано у винаході. Препарат антигену гепатиту переважно містить менше ніж 0,025мкг ртуті на 20мкг білка, що відповідним чином виміряне за допомогою абсорбційної спектрофотометрії. Переважно очищення здійснюють у відсутності тіомерсалу, і очищений антиген є цілком вільним від тіомерсалу. Переважно цей антиген є стабільним, відповідно, по суті таким же стабільним, як і антиген гепатиту,очи щений у присутності тіомерсалу, як, наприклад, викладено у Прикладі 1 винаходу. Переважно антиген гепатиту є імуногенним. Переважно відновний агент додають у процесі очищення антигену, переважно після вирощування клітин, експресуючих цей антиген. Переважно відновним агентом є цистеїн, дитіотрейтол, b-меркаптоетанол або глутатіон, причому найпереважнійшим є цистеїн. Відповідно, за винаходом переважно запропонований спосіб отримання стабільного імуногенного антигену гепатиту В без слідів тіомерсалу, при якому цей антиген очищують у присутності цистеїну. Переважно очищення здійснюють у присутності розчину цистеїну. Переважно цистеїн, у розчині або в порошкоподібній формі, додають під час процесу до кінцевої концентрації від 1 до 10мМ, переважно від 1 до 5мМ. Найбільш переважно цистеїн додають до кінцевої концентрації приблизно 2мМ. Переважно цистеїном є L-цистеїн. Крім того, за винаходом запропонований спосіб отримання стабільного антигену гепатиту В без слідів тіомерсалу, при якому неочищений антиген 5 79735 піддають гель-проникаючій хроматографії, піддають іонообмінній хроматографії і змішують з відновним агентом, що має вільну -SH груп у. Переважно іонообмінною хроматографією є аніонообмінна хроматографія. Крім того, за винаходом запропонований антиген гепатиту В, вільний від тіомерсалу, який отримують способом виробництва за винаходом, причому цей антиген є щонайменше таким же імуногенним і антигенним, як і антиген гепатиту В, виготовлений у присутності тіомерсалу. За винаходом також запропонований імуногенний антиген гепатиту В, що має середнє співвідношення ELISA (імуноферментний твердофазний аналіз; enzyme-linked immunosorbent assay)/білок більше ніж 1,5 і вміст RF1 зі значенням ІК50, яке щонайменше в 3 рази нижче, ніж для поверхневого антигену гепатиту В, виготовленого у присутності тіомерсалу. Наступний аспект винаходу стосується способу отримання антигену гепатиту, що підходить для використання у вакцині, при якому цей антиген очищують у присутності тіомерсалу з наступною обробкою антигену у присутності відновного агента, що містить вільну -SH груп у. Відповідно, за цією обробкою іде стадія очищення, така як стадія діалізу, для видалення тіомерсалу. Переважно відновним агентом є цистеїн, дитіотрейтол (ДТТ), глутатіон або b-меркаптоетанол. Антиген гепатиту В за винаходом можна використовувати або для лікування, або для профілактики інфекцій гепатиту В, особливо для лікування або профілактики, наприклад, хронічних інфекцій гепатиту В. Крім того, за винаходом запропонований вакцинний препарат, що містить антиген гепатиту В за винаходом у сполученні з ад'ювантом. Переважно цим ад'ювантом є сіль алюмінію або переважний стимулятор ТН1-клітинної відповіді. Переважно антигеном є поверхневий антиген гепатиту В. Отримання поверхневого антигену гепатиту В добре відомо з літератури. [Дивися, наприклад, Harford et al. in Develop. Biol. Standard 54, page 125 (1983), Gregg et al. in Biotechnology, 5, page 479 (1987), EP-A-0226846, EP-A-0299108 та наведені в цих документах посилання]. Вираз «поверхневий антиген гепатиту В» або «HBsAg», як воно використано тут, включає в себе будь-який HBsAg антиген або його фрагмент, що виявляє антигенність поверхневого антигену HBV. Варто розуміти, що на додаток до 226 амінокислотної послідовності антигену HBsAg S [див. Tiollais et al. Nature, 317, 489 (1985) і наведені там посилання], HBsAg, як описано тут, може, якщо бажано, містити при-S-послідовність цілком або частину її, як описано в наведених ви ще посиланнях і в [ЕР-А-0278940]. HBsAg, як описано тут, може також відноситися до варіантів, наприклад до "мутанта, що вислизнув", («escape mutant»), описаному в [WO 91/14703]. HBsAg може також відноситися до поліпептидів, описаних у [ЕР 0198474 або ЕР 0304578]. 6 Звичайно HBsAg буде знаходитися у формі частки. У особливо переважному втіленні HBsAg буде складатися по суті з HBsAg S-антигену, згаданого вище. Вакцина може переважно містити в собі фармацевтично прийнятний ексципіент, такий як підходящий ад'ювант. Підходящі ад'юванти є у продажу, такі як, наприклад, неповний ад'ювант Фрейнда (Freund's Incomplete Adjuvant) і повний ад'ювант Фрейнда (Freund's Complete Adjuvant) (Difco Laboratories, Detroit, Ml); ад'ювант 65 Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); солі алюмінію, такі як гель гідроксиду алюмінію (галуни) або фосфа т алюмінію; солі кальцію, заліза або цинку; нерозчинна суспензія ацильованого тирозину; ацильовані цукру; катіонно або аніонно перетворені полісахариди; поліфосфазени; мікросфери, що біологічно розпадаються; монофосфорилліпід А та Quil А. Цитокіни, такі як гранулоцитарномоноцитарний колонієстимулуючий фактор (GMCSF) або інтерлейкін-2, -7 або -12, можна також використовува ти як ад'юванти. У препаратах за винаходом переважно, щоб ад'ювантна композиція індукувала імунну відповідь переважно ТН1-типу. Високі рівні цитокінів Тh1типу (наприклад ІФН-g, ФНО-a, ІЛ-2 та ІЛ-12) мають тенденцію до переважної індукції клітинноопосередкованих імунних відповідей на введений антиген. У переважному втіленні, у якому відповіддю є відповідь переважно Тh1-типу, рівень цитокінів Тh1-типу буде зростати в більшому ступені, ніж рівень цитокінів Тh2-типу. Рівні цих цитокінів легко оцінити, використовуючи стандартні аналізи. Як огляд сімейств цитокінів [дивися Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989]. Відповідно, підходящі ад'юванти для використання при індукції відповіді переважно Тh1-типу мають, наприклад, комбінацію монофосфорилліпіду А, переважно 3-дез-О-ацильованого монофосфориліпіду A (3D-MPL), разом із сіллю алюмінію. Інші відомі ад'юванти, що переважно індукують імунну відповідь ТН1-типу, мають CpG-вмісні олігонуклеотиди. Ці олігонуклеотиди характеризуються тим, що динуклеотид CpG є неметилованим. Такі олігонуклеотиди добре відомі та описані, наприклад, у [WO 96/02555]. Імуностимуляторні послідовності ДНК також описані, наприклад, [Sato et al., Science 273:352, 1996]. Іншим переважним ад'ювантом є сапонін, переважно QS21 [Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA], який можна використовува ти окремо або у комбінації з іншими ад'ювантами. Наприклад, у посилену систему включена комбінація монофосфорилліпіду А та похідного сапоніну, така як комбінація QS21 і 3D-MPL, як описано в [WO 94/00153], або менш реактогенна композиція, де QS21 блокований холестерином, як описано в [WO 96/33739]. Інші переважні препарати містять емульсію «олія у воді» та токоферол. Особливо сильний ад'ювантний препарат, у який включені QS21, 3D-MPL і токоферол в емульсії «олія у воді», описаний у [WO 95/17210]. Особливо ефективний ад'ювантний препарат, у який включені QS21, 3D-MPL і токоферол в ему 7 79735 льсії «олія у воді», описаний у [WO 95/17210] і є переважним препаратом. Відповідно до одного втілення винаходу запропонована вакцина, що містить поверхневий антиген гепатиту В за винаходом, що додатково містить ТН1-індукуючий ад'ювант. Переважним втіленням є вакцина, в якій цей ТН1-індукуючий ад'ювант обраний із групи ад'ювантів, що містить: 3D-MPL, QS21, суміш QS21 і холестерину, і CpGолігонуклеотид. Іншим переважним втіленням є вакцина, що містить поверхневий антиген гепатиту В, який як ад'ювант має монофосфорилліпід А або його похідне, QS21 і токоферол в емульсії «олія у воді». Переважно вакцина додатково містить сапонін, найбільш переважно QS21. Інший конкретний підходящий ад'ювантний препарат, що включає CpG і сапонін, описаний у [WO 00/09159] і є переважним препаратом. Найбільш переважним сапоніном у даному конкретному препараті є QS21. Переважно цей препарат додатково містить емульсію «олія у воді» і токоферол. За винаходом також запропонований вакцинний препарат, що містить поверхневий антиген гепатиту В за винаходом разом з ад'ювантом і який додатково має один або більш ніж один антиген, обраний із групи, що складається з: дифтерійного анатоксину (D), правцевого анатоксину (Т), безклітинних коклюшних антигенів (Ра), інактивованого вірусу поліомієліту (IPV), антигену Haemophilus influenzae (Hib), антигену гепатиту А, вірусу простого герпесу (HSV), хламидії, GSB, HPV, антигенів Streptococcus pneumoniae і Neisseria. Антигени, що дають захист від інши х захворювань, можна також комбінувати у вакцинному препараті за винаходом. В одному конкретному втіленні вакцинний препарат містить поверхневий антиген гепатиту В, отриманий способом виробництва за винаходом, разом з ад'ювантом і інактивованим вірусом поліомієліту. За винаходом також запропонований спосіб лікування та/або профілактики вірусних інфекцій гепатиту В, при якому суб'єктові людині або тварині, що страждає вірусною інфекцією гепатиту В або сприйнятливому до неї, вводять безпечну й ефективну кількість вакцини за винаходом для профілактики та/або лікування інфекції гепатиту В. У даному винаході також запропоноване використання поверхневого антигену гепатиту В за винаходом у виготовленні ліків для лікування пацієнтів, що страждають вірусною інфекцією гепатиту В, такою як хронічна вірусна інфекція гепатиту В. Вакцина за винаходом буде містити імунопротективну кількість цього антигену, і її можна отримати за допомогою загальноприйнятих методик. Вакцинний препарат в цілому описаний у [Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978]. Інкапсуляція у ліпосоми описана, наприклад, Fullerton, [патент США 4235877]. Кон'югація білків з макромолекулами розкрита, 8 наприклад, Likhite, [патент США 4372945], і [Armor et al., патент США 4474757]. Використання Quil А розкрите Dalsgaard et al., [Acta Vet Scand. 18:349 (1977)]. 3D-MPL доступний від Ribi Immunochem, USA, і розкритий у [заявці на патент Великобританії №2220211 і в патенті США 4912094]. QS21 розкритий у [патенті США №5057540]. Винахід проілюстрований, але не обмежений наступними прикладами, де: на Фіг.1 проілюстрований процес отримання Engerix В™, вільний від тіомерсалу; на Фіг.2 проілюстрований електрофоретичний аналіз у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (SDS-PAGE) серій із загальної маси антигену; і на Фіг.3 показані залишкові дріжджові білки в серіях із загальної маси антигену, отриманого за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу. Приклад 1: Процес отримання поверхневого антигену гепатиту В у присутності тіомерсалу Поверхневий антиген гепатиту В (HBsAg) моновалентної вакцини гепатиту В від SB Biologicals (Engerix В™) експресується у вигляді рекомбінантного білку в Saccharomyces cerevisiae [дивися Harford et. al. loc. cit.]. Білок 24кД продукується внутрішньоклітинно і накопичується в рекомбінантних дріжджових клітинах. Наприкінці ферментації дріжджові клітини збирали та руйнували у присутності м'якого сурфактанту, такого як Твін 20, для вивільнення бажаного білка. Після цього клітинний гомогенат, що містить розчинні частки поверхневого антигену, повторно очищали в серії осаджень, а потім концентрували ультрафільтрацією. Подальше очищення рекомбінантного антигену проводили в послідовних хроматографічних поділах. На першій стадії неочищений концентрат антигену піддавали гель-проникаючій хроматографії на середовищі сефароза 4В. Тіомерсал був присутній у буфері для елюції на стадії гельпроникаючої хроматографії 4В. Буфер для елюції мав наступний склад: 10мМ Трис, 5% етиленгліколь, рН7,0, 50мг/л тіомерсалу. Тіомерсал включали в даний буфер для контролю біологічних забруднень. Більшу частину цього тіомерсалу видаляли під час наступних стадій очищення, включаючи іонообмінну хроматографію, ультрацентрифугування та знесолення (гель-проникаюча хроматографія), так щоб препарати очищеної маси антигену, отримані за допомогою основного процесу, містили приблизно 1,2мкг і менше ніж 2мкг тіомерсалу на 20мкг білка. Стадію іонообмінної хроматографії проводили, використовуючи ДЕАЕ-матрицю, а потім цей пул піддавали ультрацентрифугуванню в градієнті цезію на 4-х попередньо встановлених шарах різних концентрацій хлориду цезію. Частки антигену відокремлювали від забруднюючих клітинних складових частин відповідно до їх щільності в зазначеному градієнті і елюювали наприкінці процесу центрифугування. Потім хлорид цезію видаляли з даного пулу за допомогою другої гельпроникаючої хроматографії на сефарозному гелі. Коли HBsAg отримували за допомогою процесу, що містить тіомерсал у буфері для гель 9 79735 проникаючої хроматографії на 4В, концентрації білка більше 30мг/мл виділяли у ви гляді об'єднаного HBsAg, що містить фракції з градієнта CsCI, що відповідають еквівалентній концентрації HBsAg, як оцінювали за допомогою набору AUSZYME від Abbott Laboratories. Стадія ультрацентрифугування в CsCI успішно елімінує залишкові ліпіди, ДНК і мінорні білкові забруднення з препарату HBsAg. Її проводили шляхом зонального центрифугування в роторі Ті 15 від Beckman Instruments, Fullerton, California, зі швидкістю 30000об/хв протягом приблизно від 40 до 60 годин. Зразок, який підлягає очищенню, наносили на шари розчину CsCI з кінцевими концентраціями 0,75, 1,5, 2,5 і 3,25М CsCI. Наприкінці центрифугування цей градієнт елюювали у вигляді фракцій. Фракції, що містять HBsAg, можна ідентифікува ти по поглинанню УФ при 280нм або тестуванням розведень цих фракцій з використанням набору AUSZYME. Смуга HBsAg присутня при щільності від 1,17 до 1,23г/см 3. Розчин, що містить очищений HBsAg, стерильно фільтрували перед використанням для отримання вакцинного препарату. Очищення з дріжджового клітинного лізату є складним, оскільки антиген продукується внутрішньоклітинно, і для отримання очищеної маси антигену необхідний ряд методик розподілу, призначених для елімінації різних типів (дріжджових) забруднюючих речовин. Стадії очищення є важливими, оскільки продукт, що підлягає очищенню, є ліпопротеїновою часткою, що містить множинні копії поверхневого антигенного поліпептиду, і ця стр уктура повинна бути збережена протягом усього процесу очищення. Особливість даного процесу полягає в тому, що він дає частки поверхневого антигену, які є цілком імуногенними, без необхідності подальшої хімічної обробки для посилення імуногенності (у порівнянні з [ЕРО135435]). Деталі цього процесу отримання додатково описані в [Європейському патенті 0199698]. Приклад 2 Отримання і характеристика HBsAg дріжджового походження за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу 1. Отримання та очищення HBsAg дріжджового походження 1.1. Опис процесу отримання Поверхневий антиген гепатиту В можна отримати шляхом ферментації відповідного штаму Saccharomyces cerevisiae, наприклад описаного в[ Harford et al (loc. cit.)]. Наприкінці великомасштабного процесу ферментації рекомбінантного штаму дріжджів клітини збирали та руйнували у присутності м'якого сурфактанту, такого як Твін 20. Потім поверхневий антиген виділяли за допомогою багатостадійної процедури екстракції та очищення, так само як описано вище в Прикладі 1, аж до стадії першої гель-проникаючої хроматографії на сефарозі 4В. 1.2. Процес очищення, вільний від тіомерсалу У процес, вільний від тіомерсалу, внесли наступні дві зміни у порівнянні з процесом, описаним у Прикладі 1. 10 1. Буфер для елюції на стадії гельпроникаючої хроматографії на 4В більше не мав тіомерсал. 2. Цистеїн (кінцева концентрація 2мМ) додавали до пулу елюату зі стадії аніонообмінної хроматографії. Виявлено, що виключення тіомерсалу з буфера для гель-проникаючої хроматографії на 4В може призвести до осадження часток HBsAg під час стадії центрифугування в градієнті щільності CsCI із втратою продукту та агрегацією або грудк уванням виділеного антигену. Додавання цистеїну в кінцевій концентрації 2мМ у п ул елюату з попередньої стадії аніонообмінної хроматографії запобігає осадженню і втрату антигену під час центрифугування в градієнті щільності CsCI. Цистеїн є переважною речовиною для даної обробки, оскільки він є амінокислотою, що зустрічається в природі, і його можна видалити на наступній стадії знесолення на колонці для гельпроникаючої хроматографії, використовуючи як матрицю колонки сефарозу 4BCLFF. Ніяких інших змін у процес виробництва у порівнянні з процесом, описаним у Прикладі 1, не вносилося. Процес, вільний від тіомерсалу, дає загальну масу антигену зі ступенем чистоти і властивостями, порівнянними з антигеном, отриманим у процесі Прикладу 1. 1.2а Гадають, що тіомерсал, доданий у буфер 4В в концентрації 50мкг/мл, розкладається, і отримана в результаті етилртуть може ковалентно приєднуватися до вільних сульфгідрильних груп на цистеїнових залишках білка. Цей білок містить 14 цистеїнових. залишків, з яких 7 локалізовані між положеннями 101 і 150. Вважають, що дана ділянка білка локалізована на поверхні частки і має головну антигенну ділянку HBsAg, що включає імунодомінантну ділянку а та сайт розпізнавання для моноклонального антитіла RF1 [Waters J et al, Postgrad. Med. J., 1987:63 (Suppl.2): 51-56 і Ashton-Rickardt and Murray, J. Med. Virology, 1989: 29: 196]. Антиген, очи щений з використанням тіомерсалу, який присутній у буфері для гель-проникаючої хроматографії на 4В, містить приблизно 0,5-0,6мкг ртуті наприкінці процесу очищення. Ця ртуть цілком не віддаляється простим діалізом. В одному експерименті на препараті із загальної маси антигену визначили 0,56мкг ртуті на 20мкг білка. Цей препарат піддавали діалізові протягом 16 годин при кімнатній температурі проти 150мМ NaCI, 10мМ NaPO4 буфера з р 6,9. Наприкінці діалізу визначили концентрацію 0,33мкг Нg на 20мкг білка. Навпроти, діаліз у присутності відновного агента, такого як L-цистеїн у концентрації від 0,1 до 5,0мг/мл, дитіотрейтол (ДТТ) у концентрації 50мМ або 2-меркаптоетанол у концентрації 0,5М, з наступним другим діалізом для видалення відновного агента, призводив до зниження вмісту ртуті в препараті антигену до концентрації менше ніж 0,025мкг ртуті на 20мкг білка. Ця концентрація є 11 79735 самою низькою границею виявлення даного способу. Вміст ртуті визначали абсорбційною спектрофотометрією. Ан тиген розбавляли в розчині, що містить 0,01% мас/об біхромату калію (К2Сr2O7) і 5% об/об азотної кислоти. Стандартні розчини готували з тіомерсалом як джерело ртуті. Атомну абсорбцію зразка і стандартних розчинів вимірювали після випару в парогенераторі з ртутєспецифічним катодом при 253,7нм. Атомну абсорбцію рідини, що розбавляє, виміряли як контроль. Вміст ртуті в зразку обчислювали за допомогою каліброваних кривих, о триманих на підставі стандартних 12 розчинів. Результати виражали в мкг ртуті на 20мкг білка. 1.3 Отримання загальної маси антигену, вільного від тіомерсалу Стадії процесу очищення загальної маси антигену показані на Фіг.1. 1.4 Склад вакцинного препарату, виго товленого без тіомерсалу Типовий кількісний склад для вакцини гепатиту В без консерванту, виготовленої з антигену, отриманого за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, представлений у Таблиці 1. Таблиця 1 Складова частина Кількість на мл Активна складова частина - білок, щонайменше 95% якого складає HBsAg 20мкг Гідроксид алюмінію (адсорбент) (виражений у вигляді АІ 2О 3) 0,95мг Хлорид натрію 9,0мг (максимум) Дигідрат гідрофосфату натрію 0,98мг Дигідрат дигідрофосфата натрію 0,71мг Вода для ін'єкцій, скільки потрібно до 1,0мл Полісахариди вимірювали методом Dubois et Цей склад можна варіювати додаванням 3Dal. [Anal. Chem. 1956:28:350]. MPL та/або інших ад'ювантів. Ліпіди виміряли, використовуючи наявний у 2. Характеристика антигену із загальної маси і продажу набір (Merkotest Total Lipids 3321) від вакцини, отриманих за допомогою процесу, вільE.Merck, B.P. 4119, Darmstad D-6100, Germany. ного від тіомерсалу Вміст ДНК вимірювали методом Threshold, ви2.1 Тести та аналізи очищеної маси антигену користовуючи апарат і реагенти, доступні від 2.1.1 Основа для порівняння Molecular Devices Corp., GutenbergstraBe 10, Три серії із загальної маси антигену були Ismaning, Munich, Germany. отримані за допомогою процесу, вільного від тіоЗначення, визначені в цих тестах і аналізах, мерсалу, відповідно до даного прикладу (Приклад знаходяться в діапазоні, що спостерігається для 1.2) та ідентифіковані як HEF001, HEF002 і серій із загальної маси антигену, виробленого з HEF003. Ці серії порівняли із серією із загальної використанням тіомерсалу в буфері для елюції на маси антигену (НЕР2055), отриманого за допомостадії гель-проникаючої хроматографії на сефарогою попереднього процесу (як описано в Прикладі зі 4В, за винятком антигенної активності згідно 1) у присутності тіомерсалу. ELISA. Значення для даного вимірювання для 2.1.2 Тести та аналізи антигену із загальної трьох препаратів HEF вище (1,63-2,25), ніж виявмаси лені для серії із загальної маси антигену НЕР2055, Три серії із загальної маси антигену, отримані що має співвідношення ELISA/білок 1,13. Співвідза допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, ношення ELISA/білок, виміряні за допомогою набули протестовані, і результати підсумовані в бору AUSZYME для тіомерсалвмісних серій із заТаблиці 2. гальної маси антигену, як правило, дорівнюють Вміст білка вимірювали методом Lowry et al [J. приблизно 1,0 і знаходяться в межах діапазону Biol. Chem. 1951:193:265]. 0,8-1,2 і дуже рідко перевищують 1,4. Вміст ендотоксину вимірювали за допомогою 2.1.3 Електрофоретичний аналіз у поліакриметодики утворення гелю Limulus, використовуючи ламідному гелі з додецилсульфатом натрію (SDSнаявний у продажу набір від Cape Cod Associates, PAGE) [704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA]. Цей реаПрепарати із загальної маси антигену аналізугент стандартизований по еталонному стандарту вали за допомогою електрофоретичного аналізу в ендотоксину US Pharm. Endotoxin Reference поліакриламідному гелі з SDS у відновних умовах і Standard. при фарбуванні Кумасі синім. В усі х зразках виявТвін 20 вимірювали методом Huddleston and лена основна смуга при 24 К із слідами димерного Allred [J. Amer. Oil Chemist Soc, 1965:42:983]. білка. Чистоту зразків оцінили як високу (ступінь Вміст HBsAg вимірювали за допомогою наявочищення >99%), що визначили на підставі відсутних у продажу набору AusZYME від Abbott ності видимих смуг забруднюючих білків. Laboratories, One Abbott Park Road, Abbott Park, IL Зразки (1мкг) препаратів із загальної маси ан60064, USA. Використовували методику В від тигену аналізували за допомогою електрофоретивиробника. Серію із загальної маси антигену, чного аналізу в поліакриламідному гелі з SDS у очищеного за допомогою процесу, що містить відновних і не відновних умовах і при фарбуванні тіомерсал, використовували як стандарт для сріблом (Фіг.2). У відновних умовах у зразках випобудови кривої доза-відповідь. явили інтенсивну смугу, що мігрує при 24 К, із слідами димерних і мультимерних форм. Картини 13 79735 гелів невідмітні від картини НЕР2055 як порівняння. Пробіг зразків також проводили у не відновних умовах. В ци х умовах менша кількість матеріалу мігрувала при 24 К і кількість поліпептиду, що мігрує в димерних і мультимерних положеннях, збільшилася. Серії із загальної маси антигену, вільного від тіомерсалу, очевидно, мають трохи більш високу ступень полімеризації, ніж порівняльна серія НЕР2055. Ідентичність 24 К поліпептиду, виявленого фарбуванням Кумасі синім або сріблом, підтвердили за допомогою Вестерн-блотінгу з використанням поліклональних антитіл кролика, індукованих проти HBsAg плазми. У препаратах із загальної маси антигену виявлена основна смуга при 24 К разом з димерними і тримерними формами. Ця методика дозволила виявити мінорні сліди продуктів розпаду білка поверхневого антигену. Не було різниці між антигеном із загальної маси, отриманого за 14 допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, і серією НЕР2055. Присутність залишкових дріжджових білків аналізували за допомогою електрофоретичного аналізу в поліакриламідному гелі з SOS у відновних умовах і Вестерн-блотінгу з кролячою поліклональною антисироваткою, індукованою проти дріжджових білків (Фіг.3). Ця методика є якісною і не дозволяє здійснити кількісне визначення домішок. Однакова картина смуг виявлена для всіх трьох серій із загальної маси антигену, отриманих за допомогою процесу, вільного від тіомерсалу, і серії НЕР2055 за одним винятком. Більш важка смуга фарбування, що присутня при ±23К в НЕР2055 із загальної маси антигену, практично відсутня у 3 препаратах HEF. Вестернблотінг показав, що результатом процесу очищення, вільного від тіомерсалу, є більш чистий антигенний продукт. Таблиця 2 Результати тестів і аналізів очищеної, вільної від тіомерсалу загальної маси антигену Тест РН Вміст білка по Лоурі Вміст ендотоксину Вміст Твін 20 Антигенна активність по ELISA Співвідношення ELISA/білок Вміст полісахаридів Вміст ліпідів Вміст ДНК по Threshold HEF001 6,8 1312мкг/мл