Спосіб девіталізації мікроорганізмів в рідких середовищах

1. Спосіб девіталізації мікроорганізмів в рідинних середовищах при охолодженні, який відрізняється тим, що проводять девіталізацію протягом 70-120 с при спільній дії змінного магнітного поля частоти 50 Гц з індукцією, вищою за 30 мТл, і охолодження до температур, що лежать у діапазоні від мінус 20 °С до мінус 45 °С. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що передбачає проведення девіталізації мікроорганізмів, суспендованих в попередньо заскладованих контейнерах з рідинним об'єктом, при температурі зовнішнього середовища, що лежить у діапазоні від мінус 20 °С до мінус 45 °С. Галузь, для якої призначається спосіб - це рідинні об'єкти суспензії, що містять живі клітини, зокрема, бактеріальні культури у рідких середовищах, які існують або створюються штучно в процесі фізичних, хімічних або біологічних перетворень та обробок у біотехнології, медицині, виробництві харчових продуктів, в справі знешкодження відходів. У харчовій промисловості великого значення набуває стерилізація засобів виробництва і готової продукції, зокрема продуктів тривалого зберігання. Не менш важливою є проблема стерилізації продукції біотехнологічних галузей. До фізичних методів стерилізації, які в принципі при досить тривалій дії можуть забезпечити знищення мікроорганізмів, належить обробка струменями водяної пари чи гарячих газів, зокрема, повітря, вакуумування, глибоке заморожування, обробка ультразвуком або високоенергетичним електромагнітним випромінюванням. При застосуванні фізичних методів стерилізації продуктів та медикаментів існує обмеження щодо інтенсивності діючого фізичного фактора продукт не повинен втрачати своїх корисних властивостей. Для стерилізації, в процесі якої температура не перевищує 60°С, введений термін - холодна стерилізація. Важливого значення набуває дотримання статусу холодної стерилізації і в хірургії у зв'язку з тим, що все більшого поширення набуває використання хірургічних інструментів з вмонтованими в них сенсорами, мікросхемами, мікроприводами, як правило, в корпусах з пластмаси, недостатньо стійкої до підвищених температур. Відомо, що стійкість до дії бактерицидних факторів залежить і від виду мікроорганізмів. Так, всі патогенні мікроорганізми вегетативного типу і віруси можна знищити витримуванням достатньо довго при температурі 60°С - експозиція залежить від виду мікроорганізмів і триває від кількох десятків хвилин до 10 годин. Значно стійкіші до дії шкідливих зовнішніх впливів спороутворюючі мікроорганізми і спори. (19) UA (11) 91475 (13) C2 (21) a200910407 (22) 14.10.2009 (24) 26.07.2010 (46) 26.07.2010, Бюл.№ 14, 2010 р. (72) РАЙЧЕНКО ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, МОСІЄНКО ВОЛОДИМИР СЕРГІЙОВИЧ, ЧЕРНЕНКО ЛЕОНІД ІВАНОВИЧ, ЯНІШ ЮРІЙ ВАДИМОВИЧ, ДЕРЕВ'ЯНКО ОЛЕНА ВАСИЛІВНА, КАРНАУШЕНКО ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ МАТЕРІАЛОЗНАВСТВА ІМ. І.М. ФРАНЦЕВИЧА НАН УКРАЇНИ (56) US 5326530 A, 05.07.1994 SU 1785437 A3, 30.12.1992 JP 11042273 A, 16.02.1999 RU 2188798 C1, 10.09.2002 GB 515195 A, 29.11.1939 UA 25843 C2, 26.02.1999 3 Відомий спосіб знищення мікроорганізмів, що використовує поряд з іншим магнітне поле (МП) описано в патенті США №5326530, МПК А 61 L 2/00,1997p., "Energy-Efficient Electromagnetic Elimination of Noxious Biological Organisms". Вказаний спосіб передбачає розміщення дисперсних об'єктів зі шкідливими бактеріями в камері, де створюються неоднорідні магнітне та електричне поле. Електричний струм з міжчастинними розрядами та породжене їм МП, що просякають об'єкт, призводять до девіталізації бактерій, які знаходяться в об'єкті. Недоліком згаданого способу є використання електромагнітного поля, причому для девіталізації шкідливих бактерій необхідно накладати на об'єкт напругу порядку 3000В. Близьким за ефектом до винаходу, що заявляється, є патент СРСР №1785437, кл. А 61 L 2/02, 2/18, 1991р. публ.30.12.92, Бюл.№48 "Способ стерилизации медицинских инструментов, содержащих каналы и полости, и устройство для его осуществления". Недоліком такого способу є дуже складна методика знищення мікроорганізмів, а також необхідність заморожування до значно нижчих (порядку мінус 110°С), ніж у способі, що заявляється, температур. Торчинською Н.А. на прикладі 9311 досліджених мікроорганізмів доведена синергійність дій нагрівання одночасно з обробкою -променями з кобальтової гармати ("О терморадиационном действии на микроорганизмы и возможности его использования для стерилизации в медицине." - Автореф. дисс. ... канд. мед. наук, Москва, 1977). Відомі також інші приклади синергійної дії двох факторів: ультрависокочастотне електромагнітне випромінювання активує дію хімічних бактерицидних речовин, прикладання МП одночасно з введенням до організму-пухлиноносія цитостатичних препаратів дозволяє зменшити нищівну для онкоутворень дозу цих препаратів. За прототип нами взятий спосіб знищення спорових мікроорганізмів, описаний в книзі В.Н. Вашкова "Средства и методы, применяемые в медицине", Москва: "Медицина", 1973. Згідно з цим способом для девіталізації деяких бактеріальних спор використовують 100-годинну експозицію при температурі рідкого водню (мінус 252°С); для девіталізації бактерій черевного тифу потрібна експозиція при температурі рідкого водню більше 2 годин. Недоліками цього способу є: 1) надмірна довготривалість процесу стерилізації; 2) ускладненість отримання настільки низьких температур: потрібно спочатку отримати рідкий азот і вже при температурі кипіння азоту (мінус 196°С) вести процес зрідження водню; 3) імовірність появи мікротріщин на інструменті, що призводить до необхідності збільшення кількості циклів стерилізації і величини перепаду температур. Задача винаходу, що заявляється - забезпечення девіталізації мікрофлори, використовуючи синергійну дію заморожування та змінного магніт 91475 4 ного поля (ЗМП). Мотивацією розробки винаходу "Спосіб девіталізації мікроорганізмів в рідких середовищах" є задача досягти знищення мікроорганізмів за рахунок використання мінімальної кількості пристроїв, етапів технологічної обробки та скорочення загальної експозиції. Це досягається тим, що мікроорганізми у рідких середовищах піддаються спільній дії ЗМП частоти 50Гц з індукцією, вищою 30мТл, і охолодженням до температур, що лежать в діапазоні від мінус 20°С до мінус 45°С на протязі 70-120с, або мікроорганізми, суспендовані в попередньо заскладованих контейнерах з рідким об'єктом при температурах зовнішнього середовища, що лежать в діапазоні від мінус 20°С до мінус 45°С, піддають дії змінного поля частотою 50Гц з індукцією, вищою 30мТл. Досліджували вплив ЗМП, глибокого заморожування окремо та комбінації вказаних факторів на поведінку бактерій. Для дослідження впливу комбінованого застосування низьких температур та МП було проведено серію експериментів на культурі, яка є представником непатогенної спороутворюючої флори Bacillus cereus. Бактерії суспендували з виконанням всіх вимог стерильності у дистильованій воді. Вплив ЗМП здійснювали за допомогою приладу, виготовленого в Інституті проблем матеріалознавства ім. І.М. Францевича НАН України; прилад було укомплектовано вимірювачем індукції МП. Індукція використаних МП становила 30мТл із частотою 50Гц. Досліди in vitro проводили при температурах від мінус 20 С до мінус 45°С. МП застосовували як на стадіях заморожування, так і на стадіях розмерзання. Експозиція при застосуванні МП складала від 120 до 900с. Для встановлення впливу МП на мікроорганізми зразки в пробірках Епендорфа, що вміщували 0,5-1мл суспензії з досліджуваними бактеріями, розташовували між полюсами електромагніта, за необхідності вимкненого. Стерильний аплікатор, де використовується рідкий азот, занурювали у зразок (рідинний об'єкт) або пробірку з рідинним об'єктом занурювали в посудину з холодоагентом. Кріовплив на бактеріальні суспензії полягав в охолодженні їх температури до температури в інтервалі від мінус 20 С до мінус 45°С і витримуванні їх при цій температурі протягом 70-120с.; температура контролювалася за допомогою термопари і реєструвалася на паперовій стрічці самописця. Розмерзання проходило у вільному режимі при кімнатній температурі і тривало щоразу близько 600с. У випадку чистого впливу МП на бактерії використовувались два режими: експозиції протягом 120с та 900с. Оскільки різниці в результатах виявлено не було, в подальшому максимальна експозиція дії МП на мікроорганізми, дорівнювала 120с. У випадку сполученої дії МП і кріовпливу МП застосовувалося тільки під час заморожування зразків, плюс ще 50с після початку розмерзання з поступовим підвищенням температури всередині пробірок Епендорфа. 5 91475 6 кількість колоній на 1см2, середній діаметр колоній (мм). Результати експериментів наведено в таблиці. Приклад 1. На мікроорганізмах Bacillus cereus було продемонстровано відсутність будь-якого впливу ЗМП на їх подальший ріст. Приклад 2. Кріовплив призводив до затримки росту Bacillus cereus терміном на 1-2 доби, після чого спостерігався ріст відселекційованої кріостабільної субпопуляції. Приклад 3. Сполучення кріовпливу і ЗМП призвело до повної загибелі Bacillus cereus. Результати представлені на кресленні. На ній правий верхній квадрант - контроль; правий нижній квадрант - дія ЗМП; лівий нижній квадрант - кріовплив; лівий верхній квадрант - кріомагнітний вплив. Після розмерзання зразків, що піддавалися кріовпливу та комбінованому впливу МП і глибокого заморожування, аліквоти суспензій Bacillus cereus (в тому числі і варіантів, що не були заморожені, контрольних зразків і зразків, на які діяли одним тільки МП), висівали у стандартні чашки Петрі на щільне живильне середовище - рибопептонний агар (РПА) і рівномірно розподіляли по їхній поверхні за допомогою шпателя Дригальського. Результати дослідів зазвичай обраховували через добу після висіву матеріалу, а в разі необхідності - щодня протягом 7 діб з подальшим культивуванням при 37 С. У бактерій візуально обліковували інтенсивність росту (4 стандартні градації: +, ++, +++, ++++) або його відсутність (-), характер росту, середню Таблиця 1 Вплив ЗМП, глибокого заморожування (кріо) та їх комбінованої дії (ЗМП + кріо) на стан Bacillus cereus № 1 2 3 4 Варіант впливу Контроль інтактний ЗМП кріо ЗМП + кріо Колоній на 1см2 поверхні РПА за 7 діб 8±1 9±1 0,5±0,03 Інтенсивність росту за 1 добу 4 доби 7 діб +++ +++ ++++ +++ +++ ++++ + ++ Даний винахід може бути використаний при обробці рідинних об'єктів, які існують або виникають в медичній промисловості, в рідкій продукції Комп’ютерна верстка М. Ломалова колоній за 7 діб, мм 3,93±0,54 2,88±0,49 10,00±1,47 харчової промисловості та у справі знешкодження потенційно небезпечних відходів. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601