Спосіб індикації шести та диференціації трьох видів збудників бабезіозів тварин у мультиплексній полімеразній ланцюговій реакції

Реферат: Спосіб визначення ДНК найпростіших роду Babesia у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена 18S рРНК. Ампліфікацію означеного фрагмента гена 18S рРНК представників роду Babesia шести видів та видову диференціацію трьох із них здійснюють за допомогою системи олігонуклеотидних праймерів двох прямих: BCANF 5'GTGACCCAAACCCTCACCAGA-3' і BSPF 5'-ССА-TTGGAGGGCAAGTCTGGT-3' та трьох зворотних: BDIVR: 5'-ТСССАА-AAGCGAAGTGCAATCTCG-3', BBOVR: 5'CCAAAGTCAACCAACGGTA-CGACA-3', BSPR: 5'-ACGAATGCCCCCAACCGTT-3', з одержанням фрагментів нуклеотидних послідовностей розмірами від 268 до 298 пар нуклеотидів (індикація найпростіших роду Babesia), 325 п. н. (індикація виду В. canis), 233 п. н. (індикація виду В. bovis) та 146 п. н. (індикація виду В. Divergem). UA 118964 U (12) UA 118964 U UA 118964 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до молекулярної біології, біотехнології та ветеринарної медицини і може бути використаний для діагностики та дослідницьких робіт. Одним із способів діагностики захворювань, що викликаються мікроорганізмами та найпростішими, є визначення останніх за унікальністю нуклеїнової кислоти, заснований на ампліфікації ДНК у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). Існує спосіб індикації та видової диференціації ДНК 6 видів бактерій роду Chlamydia (С. abortus, С. felis, С. pecorum, С. pneumoniae, С. psittaci, С. suis, ) у мультиплексній полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагментів гена головного білка мембрани (МОМР) [1]. Основною відмінністю тест-системи, що пропонується є ПЛР-ампліфікація ДНК гена 18S рибосомальної РНК шести представників роду Babesia (В. canis, В. caballi, В. divergens, В. major, В. bigemina та В. bovis), яка викликає бабезіози у собак, коней, худоби та людей, з одночасною диференціацією бабезій трьох видів (В. canis, В. bovis, В. divergens), що є найбільш поширеними в Україні. В основу корисної моделі, поставлено задачу створити праймери, що будуть обмежувати нуклеотидні послідовності гена 18S рРНК представників роду Babesia для діагностики бабезіозів ссавців. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення ДНК найпростіших роду Babesia у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена 18S рРНК, згідно з корисною моделлю, ампліфікацію означеного фрагмента гена 18S рРНК представників роду Babesia шести видів та видову диференціацію трьох із них здійснюють за допомогою системи олігонуклеотидних праймерів - двох прямих: BCANF 5'-GTGACCCAAACCCTCACCAGA-3' і BSPF 5'-ССА-TTGGAGGGCAAGTCTGGT-3" та трьох зворотних: BDIVR: 5'-ТСССААAAGCGAAGTGCAATCTCG-3", BBOVR: 5'-CCAAAGTCAACCAACGGTA-CGACA-3', BSPR: 5'ACGAATGCCCCCAACCGTT-3', з одержанням фрагментів нуклеотидних послідовностей розмірами від 268 до 298 пар нуклеотидів (індикація найпростіших роду Babesia), 325 п.н. (індикація виду В. canis), 233 п.н. (індикація виду В. bovis) та 146 п.н. (індикація виду В. Divergem). В способі визначення та видової диференціації бактерії роду Chlamydia за методом ПЛР, у способі, що пропонується також використовується такий підхід. Створення олігонуклеотидних праймерів для визначення представників роду Babesia у полімеразній ланцюговій реакції передбачало пошук як консервативних, так і поліморфних, ділянок гена 18S рРНК В. canis, В. caballi, В. divergens, В. major, В. bigemina та В. bovis, що не зустрічаються у будь-яких інших найпростіших й мікроорганізмів, та зручних для електрофоретичної детекції. Для аналізу з бази даних GenBank [2] були обрані первинні послідовності гена 18S рРНК представників роду Babesia: В. canis (FJ200218, EU622793, EU165369, EU711061), В. gibsoni (FJ55453), В. major (EU622907), B. felis (AF244912), В. divergens (EU182595, DQ866843, DQ866844), В. microti (FJ480420), В. bovis (EU407240, FJ426364, EF458215, EF458214, EF643475, EF643473, EF643466, AY150059, L19078), В. caballi (EU888901, EU642514), В. equi (AY 150063, Z15105, DQ287951). Вирівнювання нуклеотидних послідовностей проводили з використанням комп'ютерної програми "MEGA4" [3]. Згідно з винаходом, для ПЛР використовуються олігонуклеотидні праймери, які гомологічні консервативним ділянкам гена 18S рРНК найпростіших роду Babesia та варіабельним ділянкам Babesia canis, Babesia bovis та Babesia divergens. Для цього використовується система розроблених праймерів - двох прямих: BCANF: 5'-GTGACCCAAACCCTCACCAGA-3' і BSPF: 5'CCATTGGAGGGCAAGTCTGGT-3' та трьох зворотних: BDIVR: 5'TCCCAAAAGCGAAGTGCAATCTCG-3', BBOVR: 5'-CCAAAG-TCAACCAACGGTACGACA-3" та BSPR: 5'-ACGAATGCCCCCAACCGTT-3". Структуру олігонуклеотидних праймерів було сконструйовано за допомогою програми "FastPCR" [4]. Продуктом ПЛР є фрагмент гена 18S рРНК представників роду Babesia, що має розмір від 268 до 298 пар нуклеотидів, консервативний для бабезій шести видів (В. canis, В. caballi, В. divergens, В. major, В. bigemina та В. bovis), що викликає захворювання собак, коней, худоби та людей, а також фрагменти розмірами 325, 233 та 146 пар нуклеотидів, специфічні для трьох видів бабезій (В. canis, В. bovis, В. divergens), що переважно циркулюють на території України. Логічна схема системи праймерів та розмірів ампліконів, що отримуються за їх допомогою наведені на рисунку. Електрофоретичне розділення продуктів ПЛР у поліакриламідному або агарозному гелі дозволяє чітко визначати наявність ДНК шести представників роду Babesia та, за відповідним розміром ампліфікованого фрагмента, визначати видову належність В. canis, В. bovis, В. divergens. Пропонований спосіб діагностики найпростіших роду Babesia має наступну перевагу: визначення бабезій шести видів за консервативною послідовністю гена 18S рРНК з одночасною 1 UA 118964 U 5 10 15 20 25 видовою диференціацією бабезій трьох видів, що переважно викликають захворювання тварин на території України, за видоспецифічними нуклеотидними послідовностями означеного гена. Джерела інформації: 1. Патент 11834 UA, МПК А61К 39/118 (2006) Спосіб визначення ДНК збудників хламідійних інфекцій у мультиплексній полімеразній ланцюговій реакції / Ксьонз І.М., Почерняєв К.Ф., Курман А.Ф.; заявник Полтавський філіал Інституту ветеринарної медицини УААН. - № u200506196; заявл. 23.06.2005; опубл. 16.01.2006, Бюл. № 1, 2006 р. 2. GenBank (версія 03.2016 року). 3. Tamura K. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. / K. Tamura, J. Dudley, M. Nei [et al.] // Molecular Biology and Evolution. - 2007. - V.24. - P. 15961599. 4. Kalendar R. FastPCR software for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis / R. Kalendar, D. Lee, A.H. Schulman // Methods Моl Biol. - 2014. - V. 1116. - P. 271-302. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення ДНК найпростіших роду Babesia у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена 18S рРНК, який відрізняється тим, що ампліфікацію означеного фрагмента гена 18S рРНК представників роду Babesia шести видів та видову диференціацію трьох із них здійснюють за допомогою системи олігонуклеотидних праймерів - двох прямих: BCANF 5'-GTGACCCAAACCCTCACCAGA-3' і BSPF 5'-ССА-TTGGAGGGCAAGTCTGGT-3' та трьох зворотних: BDIVR: 5'-ТСССАА-AAGCGAAGTGCAATCTCG-3', BBOVR: 5'CCAAAGTCAACCAACGGTA-CGACA-3', BSPR: 5'-ACGAATGCCCCCAACCGTT-3', з одержанням фрагментів нуклеотидних послідовностей розмірами від 268 до 298 пар нуклеотидів (індикація найпростіших роду Babesia), 325 п. н. (індикація виду В. canis), 233 п. н. (індикація виду В. bovis) та 146 п. н. (індикація виду В. Divergem). Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2