Спосіб виготовлення препаратів із клітин кісткового мозку

Реферат: Спосіб виготовлення препаратів із клітин кісткового мозку включає вимивання кісткового мозку із кісток штучним середовищем, відокремлення клітин центрифугуванням, промивання їх сольовим буферним розчином з подальшою фіксацією, виготовлення мазків та фарбування розчином фарбника. Виготовлення мазків здійснюють перед їх фіксацією на склі, а фарбування здійснюють розведеним у сольовому буферному розчині фарбником. UA 120154 U (12) UA 120154 U UA 120154 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель виготовлення препаратів із клітин кісткового мозку належить до галузі підготовки зразків для досліджень, зокрема аналізу частоти мікроядер (МЯ) у кістковому мозку, і може бути використаний для оцінки генотоксичних властивостей агентів хімічної, фізичної та біологічної природи. Відомий спосіб підготування мазків з клітин кісткового мозку, який передбачає вимивання клітин кісткового мозку з кісток гризунів (стегнових) за допомогою ембріональної телячої сироватки або інактивованої сироватки крови людини 4 групи без консерванту з подальшим центрифугуванням, видаленням надосадової рідини, суспендуванням, виготовленням мазків та наступним фарбуванням розчином фарбника Романовського-Гімзи [див. Методичні рекомендації "Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом", М.2001. - 22 с]. Недоліками цього способу є використання для вимивання клітин кісткового мозку малодоступних сироваток людей і тварин, що ускладнює проведення досліджень. Найбільш близьким до заявленого за технічною суттю є спосіб отримання мазків із клітин кісткового мозку, який полягає у вимиванні клітин кісткового мозку середовищем RPMI 1640, центрифугуванні при 1000 об./хв. протягом 10 хв., видаленні супернатану, подвійному промиванні сольовим розчином PBS, повторному центрифугуванні з наступним видаленням надосадової рідини, фіксацією осаду клітин у тій самій пробірці холодним метанол оцтовим розчином, виготовленням мазків і їх фарбуванням розчином фарбника Гімза, розведеним фосфатним буфером [див. Saleh K Lack of micronuclei formation in bone marrow of rats after oral exposure to thiocyclam insecticide / K.Saleh, S.Celikler, M.A.A.Sarhan // Saudi Journal of Biological Sciences. - 2010. - Vol. 17. - P. 311-314]. До недоліків цього способу належить фіксація клітин безпосередньо у центрифужній пробірці, що ускладнює вилучення неушкоджених клітин та отримання клітинної суспензії необхідної густини для виготовлення якісних мазків. Крім того, багатократне центрифугування тривалістю 10 хв. кожне призводить до часткового руйнування клітин. В основу створення способу, який пропонується, було поставлено задачу поліпшення якості препаратів, збереження цілісності клітин та скорочення часу виготовлення мазків, а також здешевлення методу за рахунок модифікації різних етапів виготовлення гістологічних препаратів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі виготовлення препаратів із клітин кісткового мозку, що включає вимивання кісткового мозку із кісток штучним середовищем, відокремлення клітин центрифугуванням, промивання їх сольовим буферним розчином з подальшою фіксацією, виготовлення мазків та фарбування розчином фарбника, згідно із запропонованим рішенням, виготовлення мазків здійснюють перед фіксацією на склі, а фарбування здійснюють розведеним у сольовому буферному розчині фарбником. Спосіб дозволяє отримати якісні мазки із неушкоджених клітин молодих та зрілих форм еритроцитів кісткового мозку за рахунок короткочасного промивання сольовим буферним розчином та центрифугування, обережне відокремлення їх від супернананту та виготовлення мазка на склі до фіксації клітин, що знижує ризик отримання зруйнованих клітин та скорочує час виготовлення препарату. Крім того фарбник для подальшого фарбування мазка на склі розчиняється в тому ж сольовому буферному розчині, що знижує кількість використаних реактивів. Спосіб здійснюється наступним чином: Клітини кісткового мозку вимивають із кісток за допомогою шприца, що містить 1 мл середовища RPMI 1640, у центрифугальну пробірку. Отриману суспензію центрифугують, видаляють надосадову рідину мікропіпеткою та промивають сольовим буферним розчином. Процедуру повторюють двічі і центрифугують по 5 хв. зі швидкістю 1000 об./хв. Після останнього видалення надосадової рідини виготовляють мазки, фіксують їх зануренням у безводний метанол та фарбують розведеним у сольовому буферному розчині фарбником Романовського-Гімза. Приклад здійснення способу: У тварин, омертвлених шляхом зміщення хребців шийного відділу хребта, відокремлювали обидві стегнові кістки. Гострими ножицями та шматочком марлі очищували кістки від мускулів та інших тканин. Обидва кінці кісток обережно обрізали до появи отвору кісткового каналу. Заглибивши голку шприца з 1 мл середовища RPMI 1640 у проксимальний кінець обережно вимивали клітини з обох стегон у центрифужну пробірку. Отриману суспензію клітин у середовищі RPMI 1640 центрифугували протягом 5 хв. зі швидкістю 1000 об./хв. Надосадову рідину обережно видаляли мікропіпеткою з пластиковим наконечником. В пробірку обережно додавали 1 мл сольового буферного розчину PBS, видаляли його піпеткою і додавали 1 мл 1 UA 120154 U 5 10 15 нового розчину PBS, обережно суспендували та піддавали повторному центрифугуванню протягом 5 хв., 1000 об./хв. Надосадову рідину видаляли мікропіпеткою, осад обережно ресуспендували. Краплю суспензії розміром з зерно сочевиці наносили на предметне скло за допомогою мікропіпетки з пластиковою насадкою на край сухого ретельно знежиреного скла. Шліфоване скло підводили до краплі суспензії і робили мазок під кутом 45°. Мазки висушували на повітрі, фіксували зануренням на 3 хв. у безводний метанол. Фарбування мазків проводили розведеним у сольовому буферному розчині PBS фарбником Романовського-Гімза (6 крапель на 1 мл) протягом 30 хв., після чого фарбу зливали і мазки обережно промивали сольовим буферним розчином. Рештки розчину видаляли фільтрувальним папером і досушували на повітрі. Від кожної тварини брали по 3 мазки, в кожному з яких здійснювали аналіз мікроядер при збільшенні ×1000 під мікроскопом Primo Star фірми Zeiss за допомогою об'єктива з масляною імерсією для підрахунку клітин з мікроядрами на кожні 2000 поліхроматофільних еритроцитів. Таким чином, запропонований спосіб дає можливість підвищити якість виготовлення препаратів кісткового мозку за рахунок зменшення тривалості центрифугування, спрощення процедур фіксації та фарбування мазків, що сприяє збереженню цілісності клітин у мазку, скорочує час та витрати реактивів на проведення досліджень. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб виготовлення препаратів із клітин кісткового мозку, що включає вимивання кісткового мозку із кісток штучним середовищем, відокремлення клітин центрифугуванням, промивання їх сольовим буферним розчином з подальшою фіксацією, виготовлення мазків та фарбування розчином фарбника, який відрізняється тим, що виготовлення мазків здійснюють перед їх фіксацією на склі, а фарбування здійснюють розведеним у сольовому буферному розчині фарбником. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2