Спосіб індикації днк бактерії chlamydia avium у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (момр) для її видової диференціації

Реферат: Спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia avium у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (МОМР). Ампліфікацію консервативної за нуклеотидним складом ділянки означеного фрагмента гена МОМР Chlamydia avium здійснюють за допомогою пари праймерів: прямого: ChAvMOMPL: 5' TTCTGGTGATCCTTGCGACC-3' та зворотного: ChAvMOMPR: 5'- GCTCCTAAAGTTGCACAACC 3', з одержанням фрагменту гена розміром 507 пар нуклеотидів бактерій Chlamydia avium, що є одним із видів збудників хламідіозів птахів. UA 123070 U (12) UA 123070 U UA 123070 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до молекулярної біології, біотехнології та ветеринарної медицини. Може бути використана для діагностики та дослідницьких робіт. Одним із способів діагностики захворювань, що викликаються мікроорганізмами, є визначення останніх за унікальністю нуклеїнової кислоти, заснований на ампліфікації ДНК у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). ПЛР - це циклічний процес, кожний цикл якого складається з трьох етапів: 1) денатурація нуклеїнової кислоти, що досліджується; 2) ренатурація нуклеїнової кислоти з олігонуклеотидними праймерами, що обмежують ампліфіковану ділянку; 3) синтез обмеженої праймерами ділянки ДНК до рівня виявлення. Тривалість циклу 1,5-3 хвилини, а число циклів, залежно від кількості вихідного матеріалу - від 30 до 40. Ключовим параметром, що визначає специфічність та чутливість ПЛР є "якість" праймерів: ступінь їх гомології з ДНК матрицею, відсутність взаємної та неспецифічної ренатурації. Існує спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia felis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (МОМР) [1]. Основною відмінністю тест-системи, що пропонується є ПЛР-ампліфікація ДНК Chlamydia avium, яка викликає хламідіози у голубів та птахів папугових порід. В основу корисної моделі поставлено задачу сконструювати праймери власного дизайну, що будуть обмежувати за складом нуклеотидних послідовностей ділянку гена МОМР бактерії Chlamydia avium для діагностики хламідійних інфекцій птахів. Поставлена задача вирішується тим, що як і в способі визначення бактерії Chlamydia felis за методом ПЛР, у способі, що пропонується, також використовується такий підхід. Створення олігонуклеотидних праймерів для визначення хламідійних інфекцій ссавців викликаних Chlamydia avium у полімеразній ланцюговій реакції передбачало пошук специфічних ділянок гену МОМР бактерії Chlamydia avium, що не зустрічаються у будь-яких інших бактерій роду Chlamydia, та зручних для електрофоретичної детекції. Для аналізу з бази даних GenBank [2] і PubMed [3], були обрані первинні послідовності геномів родини Chlamydia: AF269256, AF272945, CHTOMPAAD, СНТОМРАААА, DQ227703, DQ478954, DQ471955, EF202609, EU086705, EU515131, EU531729, JQ312426, KC879303, KF130872, KP984478 - Chlamydia abortus; KF366262-KF3 66266-Chlamydia avium; AF269282, GQ332575, KP165541 - Chlamydia caviae; AF269257, AF269258, AY184290, CHTOMPAAH, HQ335353, KP165540, X61096 - Chlamydia felis; KT203195-KT203217; KT203219-KT203232; LN626319 - LN626326 Chlamydia gallinacea; CHTMOMPC, CHTMOMPZ, CHTOMPAAN, CTU60196-Chlamydia muridarum; AF269279, AB512082, AB512077, EU350137, EU350138, GQ228166, GQ228169, GQ228183, GQ228185, GQ228192, GQ228194, GQ228196, HQ457484, HQ457492, HQ457493, JX272924, JF309281, JF309283-JF309286, JF309288-JF309291, JF309293-JF309295, JN016880, JN594066, JN594068, JN594085-JN594122, JX311945-JX311952, KF150132-KF150137, KF150139-KF150141, LC021417LC021422, ORF663 - Chlamydia pecorum; KJ541750-KJ541758 - Chlamydia pneumoniae; AB239849; AB284055-AB284057; AB284059-AB284066; AB468956; AB512087; AF269259AF269261; AF269263; AF269264; AF269267-AF269269; AF269265; AF269266; AF269281; AJ243525; AM050561; AY762608; AY762609; AY762611-AY762613; EF202608; EU009488EU009498; EU019091; EU048338; EU159263; EU682086-EU682090; HE687292; LN624458; LN810481-LN810483; LN810469; LN810470; LN810472; LN810474; LN810477; KF770962; KP942829; KJ205581; KJ205582; KJ205584-KJ205586; KJ205588; KJ205590; KJ205591; KJ205594; KJ205596; KJ205597; HQ616169; HQ845540; HQ845543-HQ845547; HM214490; JN411078; JQ679391-JQ679394; JQ926183; JQ312425; X12647; Y16561; Y16562 - Chlamydia psittaci; AB270720, AB270722-AB270724, AB270736, AB270737, AB270739-AB270743, AJ004876AJ004880, AJ005616, AJ440241, AF269270-AF269278, AY601751, AY601752, AY687630AY687639, CHTOMPAAM, DQ118378, KP165539, U82956, U82958-U82960 - Chlamydia suis. Згідно з корисною моделлю, для ПЛР використовуються олігонуклеотидні праймери, які обмежують консервативну ділянку гена головного мембранного білка (МОМР) бактерії родини Chlamydiaceae роду Chlamydia виду Chlamydia avium. Для цього використовується пара розроблених праймерів - одного прямого ChAvMOMPL: 5'-TTCTGGTGA-TCCTTGCGACC-3' та одного зворотного: ChAvMOMPR: 5'-GCTCCT-AAAGTTGCACAACC-3'. Продуктом ПЛР є фрагмент гену МОМР, що має розмір - 507 пар нуклеотидів специфічний для бактерії Chlamydia avium, що викликає захворювання у голубів та птахів папугових порід. Структуру олігонуклеотидних праймерів для аналізу за допомогою ПЛР було сконструйовано за допомогою програми FastPCR [4]. 1 UA 123070 U 5 10 15 Електрофоретичне розділення продуктів ПЛР у поліакриламідному або агарозному гелі дозволяє чітко визначати наявність ДНК бактерії Chlamydia avium за відповідним розміром ампліфікованого фрагмента. Пропонований спосіб індикації бактерії Chlamydia avium має наступну перевагу: діагностика хламідійної інфекції за унікальною ділянкою ДНК бактерії Chlamydia avium, що є збудником хламідіозу у голубів та птахів папугових порід. Даний спосіб забезпечує чітку диференціацію бактерії Chlamydia avium від інших видів бактерій родини Chlamydiaceae роду Chlamydia. Джерела інформації: 1. Ксьонз І.М. Пат. на винахід № 109489, а201315140, Україна, МПК С12Q 1/68, С12R 1/01. Спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia felis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (МОМР) [Текст] / Ксьонз І.М., Почерняєв К.Ф., Цівенко Т.М; заявники і власники Ксьонз І.М., Почерняєв К.Ф., Цівенко Т.М. - Заявл. 24.12.2013; опубл. 25.08.2015, Бюл. № 16. - 4 с. 2. GenBank (версія 03.2016 року). 3. PubMed (версія 03.2016 року). 4. Kalendar, R., Lee, D., and Schulman A.H. (2014) 'FastPCR software for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis', in Valla, S. and Lale, R. (eds.) DNA Cloning and Assembly Methods. Methods in Molecular Bioljgy, 1116. New York: Springer, pp. 271-302. doi: 10.1007/978-1-62703-764-8_18. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia avium у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (МОМР), який відрізняється тим, що ампліфікацію консервативної за нуклеотидним складом ділянки означеного фрагмента гена МОМР Chlamydia avium здійснюють за допомогою пари праймерів: прямого: ChAvMOMPL: 5' TTCTGGTGATCCTTGCGACC-3' та зворотного: ChAvMOMPR: 5'- GCTCCTAAAGTTGCACAACC 3', з одержанням фрагменту гена розміром 507 пар нуклеотидів бактерій Chlamydia avium, що є одним із видів збудників хламідіозів птахів. 30 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2