Спосіб одержання ізольованих клітин печінки

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине. Целью изобретения является увеличение выхода жизнеспособ ных клеток печени с повышенной степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования. Предложенный способ получения изолированных клеток печени заключается в том, что извлекают печень декапитированного животного, после перфузии органа раствором (}(енкса без кальция и глюкозы, затем печень разрезают на кусочки размером 1-3 м м 2 и осуществляют дезагрегацию путем вибрации частотой 50-90 Гц в течение 30-90 с. Данный способ позволяет получить 98% жизнеспособных клеток печени (при общем количестве 58 млн. клеток на 1 г печени) с высокой степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования (отношение скорости эндогенного дыхания, стимулированного разобщителем 2,4-диннтрофенолом, к скорости эндогенного дыхания составляет 4,2). 4 табл. о О* 1 'ЗІ 0426 Изобретение относится к биотехнологии, и может быть использовано в ществляют в камере Горяева. клеточной биологии и экспериментальРезультаты опытов по определению ной медицине. выхода жизнеспособных гепатоцитов, Цель изобретения - увеличение выпредставлены в табл. 1. Выход жизнехода жизнеспособных клеток печени с способных клеток п = 7 в повышенной степенью сопряжения дыхаТ а б л и ц а 1 ния и фосфорилирования. Способ получения изолированных клеток печени иллюстрируется следую- 10 Способ Количество клеток, Количество неповмлн щими примерами. П р и м е р 1. Вскрывают брюшную режденных из 1 г пе- из орга- гепатоции грудную полости декапитированной чени тов ( от % на крысы массой 200 г,-нижнюю полую веобщего ну перевязывают выше места ответвле- 15 количестния правой почечной вены и перевязыва клеток" вают дистальнее лигатуры, нижнюю полую вену надсекают в месте впадения ее в предсердие. В просвет сосуда Извествводят инъекционную иглу и с помощью 20 ный 50,0+2 240±40 92+1,2 перистальтического насоса проводят промывание печени 200 мл промывного Предраствора Хенкса без кальция и глюколагаезы. Печень извлекают из грудной помый 58,0+2 586+17 98+0,4 лости и разрезают на кусочки размером 25 3 1-3 мм , затем переносят в сосуд устройства, содержащий 10 мл раствора Данные, представленные в табл. 1 f состава 250 мМ сахарозы, 5 мМ КС1, показывают, что выход жизнеспособных 0,4 мМ К Н 2 Р 0 4 , 0,4 мМ NaH 2 P0 4 , 2 мМ клеток печени по предлагаемому сподитиотреитола, 1 мМ ЭДТА, 0,8 мМ 30 собу увеличивается на 67В по сравнеMgCl n и 1% альбумина. рН раствора 7,4. нию с известным. Сопряженность дыхания и фосфори• Далее включают электродвигатель и лирования исследуют полярографичесдезагрегируют кусочки печени при возки, определяя скорость эндогенного вратно-поступательном движении лести-. 35 дыхания (V ) , скорость эндогенного ка с частотой 50 Гц и амплитудой дыхания, стимулированного разобщите5 мм.. лем 2, 4-динитрофенолом (V ДНФ), Дезагрегирование осуществляют в скорость окисления сукцината-субсттечение 60 с. Полученную суспензию рата в норме не проникающего через клеток фильтруют через 4 слоя нейло( ) на и осаждают при 1500 об/мин в тече-40 плазматическую мембрану ние 1,5 мин. Полученные клетки дважды промывают раствором. Результаты опытов по эффективности окислительного фосфорилирования Жизнеспособность клеток определяют получаемых клеток печени представлепо их окрашиванию в 0 ; 2%-ном растворе витального красителя трипанового си- 45 ны в табл. 2. (Сопряжение окисления и фосфорилирования п = 6 ) , него . Т а б л и ц а Способ V. ЭНД Известный 4,3 Предлагаемый 2,32+0,3 'днФ 4,3 18,3 10,9+0,9 4,8±О,3 4,2 З 1310426 Данные, представленные в табл. 2 дезагреї СІДИЯ J U с и уи с, а частота свидетельствуют, что полученные клетвибрации 70 Гц и 90 Гц, ки характеризуются прочным сопряжеРезультаты исследований представнием процессов дыхания и фосфорилиролены в табл. 3-4, вания (отношение V. иф/^Эцд равно 4,2, Т а б л и ц а 3 что в 2,2 раза выше, чем в известном способе). Косвенная оценка проницаеВремя Жизне- Выход жиз- Выход клеток мости плазматической мембраны клеток воч- способ- неспособ- из ткани, по скорости окисления непроникающего дей- ность , ных клеток млн субстрата сукцината свидетельствует '0 ствия, на 1 г пе% о меньшей проницаемости плазматичесс чени, млн кой мембраны по сравнению с известным способом (отношение V /V 3 H A равно 30 98+2 40,0+4,8 320,0+38,4 1,8 по предлагаемому и ч,3 по известному способам). 15 90 97±3 44,0+5,4 352,0+26,2 П р и м е р 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1. Время Т а б л и ц а 4 Частота Жизне- Выход жизвибрации, способ- неспособных ность , клеток на Гц % 1 г печени, Выход клеток из ткани, млн Функциональная активность (УДНФ/Уэнд) млн 70 98+2 58,2±7,4 576+72 4,1+0,5 $0 98+2 56,8+7,2 537+64 4,0+0,4 Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ получения изолированных клеток печени путем извлечения органа, его перфузии, дезагрегации и отделения целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью Редактор И.Сегляник повышения выхода жизнеспособных клеток с повышенной степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования, дезагрегации подвергают предварительно измельченную печень, а дезагрегацию проводят с помощью вибрации с частотой 50-90 Гц в течение 30-90 с. Составитель М,Серова Техред М.Ходанич Корректор С.Шекмар Заказ 1868/26 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 г