Спосіб одержання вітамін е-зв’язуючих білків з печінки щурів

Способ получения витамин Е-связывающих белков из печени крыс, включающий гомогенизацию ее в буферном растворе, Изобретение относится к области препаративной биохимии, а именно, к способам " выделения витамин Е-связывающих белков. Известны способы получения оитамин Е-связывающих белков из цитозоля гомогенизированной печени крыс методом аффинной хроматографии (авт. св. СССР № 1405278, кл. С 07 D 311/72, заявл. в 1986 г.; авт. св. СССР № 1398357, кл. С 07 D 311/72, заявл. в 1986 г.). За прототип нами принят способ получения витамин Е-связывающих белков, описанный в G. L. Catlgnanl "Hepatic a-Tocopherol-Blndlng Protein" Methods of Enzymology, 1980, v.67, part F. p. 117-122. По прототипу печень животных (крыс, цыплят и др.) гомогенизируют в 10 мМ трисНСІ буфере с содержанием сахарозы 0,2 М центрифугирование, фильтрацию и последующее выделение целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что выделение целевого продукта осуществляют хроматографией при использовании в качестве аффинного сорбента 2, 5, 7, 8-тетраметил-2(2-метил-3-карбоксипентан)-6-оксихроман-1,6-диаминогексансефарозы 4В или 2,5,7,8- теграметил-2-(2-метил-3-аминометилпентан)-6-оксихроманглицилглицинсефарозы 4В, при этом сорбцию и промывку проводят 0,04-0,08 М трис-НСІ буфером рН 7,4-8,0, содержащим 0,25 М сахарозы, а элюцию белка осуществляют указанным буфером, содержащим 0,8-1,2 М NaCI. при рН 7,5, гомогенизированную печень центрифугируют при 10000 g и t 4°C в течение 15 мин, затем при 105000 g и t° 4°C в течение 1 часа, полученный цитозоль печени фильтруют. Аликвоту цитозоля печени инкубируют с а-а(5-метил-ЗН) токоферолом (100 нМ) в течение 4 часов при 26°С в присутствии 400-кратного избытка немеченого а-токоферола и без него, после чего центрифугированием в 10 мМ трис-НСІ буфере при рН 7,5 и содержании сахарозы 5-20% показывают наличие специфического связывания а-токоферола белком. Недостатком прототипа является то, что проводится лишь грубая очистка белков. Задачей изобретения является создание способа получения витамин Е-соязывающих белков, позволяющего путем исполь С > ел о 14562 зования в качестве аффинного сорбента 2,5,7,8-тетраметил-2(2-метил-3-карбоксипентан^б-оксихроман-і.б-диаминогексансефарозы 4В или 2,5,7,8-тетраметил-2-(2-метил-З-аминометилпентан^б-оксихроманглицилглицинсефарозы 4В, проведения сорбции и промывки трис-НСІ буфером, содержащим сахарозу, и осуществление элюции белка указанным буфером, содержащим NaCI, обеспечить повышение качества очистки белков. Для этого, в способе получения витамин Е-связывающих белков из печени крыс, включающем гомогенизацию ее в буферном растворе, центрифугирование, фильтрацию и последующее выделение целевого продукта, выделение последнего осуществляют хроматографией при использовании в качестве аффинного сорбента 2,5,7,8-тетраметил-2(2-метил-3-карбоксипелтан)-6-оксихроман-1,6-диаминогексансефарозы 4В или 2,5,7,8-тетраметил-2-(2-метил-3-аминометилпентан)-6-оксихроман-глицилглицинсефарозы 4В, при этом сорбцию и промывку проводят 0,04-0,08 М трис-НСІ буфером рН 7,48,0, содержащим 0,25 М сахарозы, а элюцию белка осуществляют указанным буфером, содержащим 0,8-1,2 М NaCI.* Новым является проведение аффинной хроматографии на специально синтезированном для выделения кислых витамин Е-связывающих белков сорбенте и выполнение условий и режимов сорбции, промывки и элюции. Предложенный способ обеспечивает качественно более высокий урооень очистки указанных белков из печени крыс: степень очистки повышается в сравнении с прототипом в 9-14 тыс. раз. Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения способа. П р и м е р 1. Получение 2,2,5,7,8-пентаметил-4-карбокси-6-оксихроман-1,6-диаминогексансефарозы 4В (аффинный сорбент 1) состоит из трех стадий. 1. В трехгорлый реактор емкостью §00 мл, снабженный обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, вносят под слой диоксана 15,2 г триметилгидрохинона, 5 мл эфирата трехфтористого бора и 8,7 мл диметилвинилкарбинола. Смесь выдерживают в течение 65 ч без доступа света, периодически подогревая на воздушной бане при t 40°С. Диоксан отгоняют под вакуумом, остаток растворяют в эфире, промывают водой, насыщенным раствором ЫаНСОз, водой, подвергают окислению треххлористым железом и проводят реакцию циклизации в пиридине при нагревании. Очистку осуществляют хроматографией на колонке с SL 100/160 5 10 15 20 25, 30 35 40 45 50 55 Lachema chemarol (ЧСФР). (Элюция гексаном и эфиром в соотношении 95:5). Получают 16 г белого кристаллического порошка - вещество № 1 (2,2,5,7,8-пентаметил-6-оксихромен-3) Тпл. 78-79°С, Rf 051 (Sllufol UV-254, гексан: эфир, 70:30); ИК-спектр (см"1): 1088 (пирановый цикл), 1628 (-СН-СН-пиранового цикла), 3528 (ОН-группа). Найдено, %: С - 77,04; Н - 8,26, С14Н18О2. Вычислено, %: С -77,01; Н -8,32. 2. В круглодонную колбу объемом 100 мл, снабженную механической мешалкой, вносят 0,025 моль (8,6 г) вещества № 1, растворенного в небольшом объеме эфира, 0,05 моль (2,3 г) муравьиной кислоты и 0,2 моль (19,6 г) серной кислоты. Перемешивают на ледяной бане в течение 2 ч. Продукт реакции экстрагируют эфиром, промывают водой до нейтральной реакции, эфир упариоают на роторном испарителе. Получают вещество hfe 2 (2,2,5,7,8-пентаметил-4-карбокси-6-оксихроман. Выход по карбоксильной группе, определенный потенциометрическим титрованием, составляет 40%. 3. К бромцианоактивированной сефарозе 4В через спейсер 1,6-диаминогексан присоединяют вещество № 2 Подсушенную отсасыванием сефарозу со спейсером суспендируют в спиртовом растворе лиганда (4,5 г лиганда в 20 мл спирта на 10 г сефарозы). К полученной суспензии по каплям добавляют 10 мл спиртового раствора (200 мг) дициклогекьилкарбодимида. Смесь перемешивают 16 ч при 4°С. Прибавляют избыток уксусной кислоты для блокирования несвязавшихся реакционных групп спейсера, перемешивают 2 ч при 4°С. После этого сефарозу промывают последовательно спиртом, смесью спирт:вода (1:1), 0,1 М НСІ, 0,1 М ЫаНСОз, водой. Получают сорбент 1. П р и м е р 2. Получение 2,2,5,7,8-пентаметил-4-аминомєтил-б-оксихроманглицилглицинсефарозы 4В (сорбент II) состоит из 3 стадий. 1. Сначала получают вещество № 1, как описано в примере 1, стадия 1. 2. В круглодонную колбу с механической мешалкой и обратным холодильником прибавляют 48,79 кг КІ, 41,09 г95% ортофосфорной кислоты и 21 г вещества № 1. Смесь перемешивают, нагревают в течение 3 ч при 80°С, охлаждают. Продукт реакции экстрагируют эфиром, промывают, сушат сульфатом натрия и перегоняют в вакууме. В эту же колбу к йодированному веществу вносят 5 г сухого цианистого натрия. Смесь сначала нагревают на водяной бане, а затем охлаждают. Реакция протекает в течение 1 ч, затем вещество п е р е г о н я ю г . Получают вещество N? 3. 14562 7,4, со скоростью 10 мл/см2/ч. Балластные Ь трехгорлый реактор, снабженный мебелки удаляют тем же буфером. Сорбирошалкой, капельной воронкой, обратным хованные белки элюируют ступенчатым солелодильником с хлоркальциевой трубкой, вым градиентом на указанном буфере: 0,4 М вносят 3,71 г литий алюминий гидрида в 91 мл эфира, затем по каплям добавляют 5 NaCI, 0,8 М NaCI, 50% этанолом. Получают три белковые фракции, витамин Е-связыеа13,02 г хлорида алюминия в 147 мл эфира, ющей активностью обладает первая. Выдеперемешивают и добавляют по каплям 21 г ляют 0,103 мг целевого белка. Степень вещества № 3, растворенного в 196 мл эфира. Реакцию проводят в течение 1 ч, по оконочистки по сравнению с цитозолем увеличичании продукт отмывают водой, эфир 10 вается в 9741 раз, удельная активность упаривают. Выход вещества по аминогрупимп/мин пе, определенной потенциометрическим мг белка титрованием, составляет 33%. П р и м е р ы 4, 5 осуществляют согласно схеме, описанной в примере 3, на аффинПолучают вещество №4 (2,2,5,7,8-пентаметил-4-аминометил~6-оксихроман). 15 ном сорбенте I. Изменение условий и режимов получения витамин Е-связыва3. К бромцианактивированной сефэрозе ющего белка, а также результаты очистки 4В через глицилглициновый спектр присоепоказаны в табл. 1. диняют лиганд-вещество 4. Условия этой П р и м е р ы 6-8. Получение витамин операции такие же, как в примере 1, стадия 3. Непрореаги|3овавшие активные группы на 20 Е-связывающих белков на аффинном сорбенте II. сефарозе инактивируют избытком этаноламина. Схема получения белков соответствует примеру 3. Получают 3 фракции, витамин П р и м е р з . Получение витамин Е-связывающих белков на аффинном сорЕ-связывающей активностью обладает пербенте 1. 25 вая. Выделяют 0,071 мг белка. Изменение режимов и условий, о также результаты очиПечень крыс гомогенизируют в 0,04 М трис-НСІ буфере, рН 7,4 с 0,25 М сахарозой стки представлены в табл. 2. (50% гомогенат). Гомогенат центрифугируют Полученные результаты по выделению при 10000 g в течение 15 мин, затем при кислых витамин Е-связывающих белков под105000 g - 60 мин. Липидную пленку удаляют 30 тверждают преимущество разработанного фильтрованием, а полученный цитозоль, соспособа на основе аффинных сорбентов I и держащий 1000 мг белка, пропускают через II при соблюдении указанных условий сорбколонку (размером 1,1x10 см) с аффинным ции, промывки и элюции в сравнении со сорбентом 1, который предварительно уравспособом-прототипом степень очистки возновешивают 0,04 М трис-НСІ буфером, рН 35 растает в 9-14 тыс. раз. Таблица 1 N примера ? Буфер для уравновешивания колонки, сорбции, промывки Буфер для элюции, содержание NaCI , Степень очистки Удельная радиоактив, ность М раз имп/мин мг белка 30105 30004 М рН 4 0,06 7,7 0,6 9611 5 0,08 8,0 0,8 9582 8 14562 Таблица 2 № примера Буфер для уравновешивания колонки, сорбции, промывки Буфер для элюции, содержание NaCI Степень очистки Удельная радиоактивность М РН М раз имп/мин мг белка 6 0,04 7,4 0,4 14250 52575 7 0,06 7,7 0,6 14103 52483 8 0,08 8,0 0,8 14047 52397 Упорядник Замовлення 4137 Техред М.Моргентал Коректор М. Самборська Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна, 101