Спосіб визначення мембранотропної активності кріопротектора

Спосіб визначення мембранотропної активності кріопротектора, що включає введення зонда в досліджувані мембрани, реєстрацію його спектра, математичну обробку спектральних даних і побудову графіка залежності знайдених спектральних параметрів від концентрації кріопротектора, який 3 також, що залежність ступеня гемолізу еритроцитів від концентрації малих гідрофільних молекул носить лінійний характер, тоді як для ліпофільних органічних молекул, до яких можна віднести частину КП, ця залежність носить нелінійний характер [2], що значно ускладнює інтерпретацію і співставлення результатів при порівнянні мембранотропних властивостей КП, які відносяться до різних класів хімічних речовин. Існує спосіб визначення мембранотропної активності речовин, який грунтується на введенні в клітини флуоресцеїн діацетату, що в клітинах гідролізується естеразами до вільного флуоресцеіна, який має гіршу проникливість, що дозволяє використовувати його як маркер цілості плазматичної мембрани [3]. Однак, застосування цього методу також має ряд обмежень, серед яких можна відзначити залежність ферментативного перетворення флуоресцеїн діацетату у флуоресцеїн від активності внутрішньоклітинних естераз, на яку, в свою чергу, можуть впливати фактори, які порушують цілісність чи проникливість мембран, а також здатність флуоресцеіна переноситись через мембрани за допомогою специфічних каналів або транспортних білків клітин печінки. В клітинах печінки, крім того, флуоресцеїн може метаболізуватись монооксигеназною системою мікросом. Все це може спотворювати результати вимірювань при роботі з клітинами. Відомий також спосіб визначення мембранотропної активності органічних сполук по зміні проникності мембран клітин для ферріціаніду калію [4]. Для цього клітини насичують сумішшю ферріціаніду калію і парамагнітного іміноксильного радикала 2,2,6,6-тетраметіл-4-оксопіперідін-1оксила, який здатний проникати всередину клітин в нормі, тоді як ферріціанід калію в непошкоджені клітини не проникає. При порушенні нормальної проникності мембран клітин внаслідок дії на мембрани органічної сполуки, яка досліджується, ферріціанід калію починає входити всередину клітин і розширювати сигнал від молекул іміноксильного радикалу, які там знаходяться. Падіння інтенсивності ЕПР-сигналу від іміноксильного радикалу є індикатором появи дефектів в структурі мембран. До недоліків методу відноситься те, що він дозволяє визначати тільки такі пошкодження мембран, які призвели до утворення пор, і не дозволяє реєструвати порушення, спричинені дією КП на етапах, які ще не призводять до утворення пор. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб визначення мембранотропної активності речовин, оснований на реєстрації сигналів ЕПР від введених в мембрани парамагнітних зондів [5]. Спосіб полягає в тому, що парамагнітний зонд (у відсутності або присутності КП) вводять в мембрани, які досліджуються, після чого на ЕПРспектрометрі реєструють спектр ЕПР зонда, виконують його математичну обробку і будують графік залежності частоти обертальної дифузії зонда від концентрації КП, на підставі якого судять про мембранотропну активність речовини. До основних недоліків цього способу можна віднести такі: 13838 4 - недостатня чутливість, пов'язана з тим, що для отримання задовільного відношення сигнал/шум треба використовувати ЕПР-зонди в кінцевих концентраціях не менш ніж 4х10-4-5х10-5М [6]. Такі концентрації є досить високими і самі по собі можуть спричинити негативний вплив на об'єкт дослідження - біомембрани. З іншого боку, при використанні менших концентрацій зондів необхідно застосовувати накопичення сигналів, яке подовжує час вимірювань; - складність інтерпретації результатів, яка полягає в тому, що навіть у випадку використання одного і того ж ЕПР-зонда, інтерпретація спектрів часто ускладнюється завдяки перетинанню спектрів ЕПР від молекул цього зонда, розташованих у водній фазі і в різних областях мембран; - великі затрати часу, зумовлені специфікою підготовки зразків для ЕПР-вимірювань, які потребують розміщення зразків в спеціальних скляних капілярах, юстировки в резонаторі спектрометра, настройки параметрів поля тощо. Для отримання адекватної інформації про стан різних областей бішару, звичайно застосовують по черзі (тобто, в окремих експериментах) декілька різних ЕПРзондів, що збільшує час вимірювань, який для одного зразка знаходиться в межах 10-15хв. і подовжує термін обробки спектрів; - висока вартість ЕПР-зондів, які використовуються для досліджень. В основу корисної моделі поставлено задачу створення такого способу визначення мембранотропної активності КП, який, за рахунок використання іншого мембранного зонда, дозволить підвищити чутливість методу, поліпшити інтерпретацію результатів, знизити матеріальні і часові витрати. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення мембранотропної активності КП, який включає введення зонда в мембрани, що досліджуються, реєстрацію його спектра, математичну обробку спектральних даних і побудову графіка залежності знайдених спектральних параметрів від концентрації КП, згідно з корисною моделлю, в мембрани вводять флуоресцентний зонд, в якості якого використовують 3-гідрокси-4'(N,N-диметиламіно)флавон (ФМЄ), на спектрофлуориметрі реєструють його спектр флуоресценції, після чого виконують математичну обробку спектральних даних, яка полягає в тому, що з спектрів визначають інтенсивності флуоресценції (F) зонда на довжинах хвиль А і Б, де А знаходиться в межах 480-535нм, Б - в межах 540-650нм, будують графік залежності відношення інтенсивностей FА/FБ від концентрації КП і за зростанням відношення FA/FБ у порівнянні з аналогічним параметром, обчисленим для даного виду мембран у відсутності КП, судять про мембранотропну активність КП. Мультипараметричний зонд ФМЄ належить до класу 3-гідроксифлавонів. Зонди цього класу при електронному збудженні здатні до ізомеризації з утворенням нормальної (N*) і таутомерної (Т*) форм [7]. Положення і інтенсивність смуг емісії кожної з форм залежать не тільки від хімічної структури зонда, але й від параметрів оточення його 5 молекул, таких як гливкість, полярність, і від здатності утворювати міжмолекулярні водневі зв'язки [8]. В мембранах ФМЄ локалізується на межі полярної і неполярної областей ліпідного бішару, що забезпечує його високу чутливість до початкових змін структури як полярної, так і неполярної зон бішару. При цьому, тільки молекули зонда, які локалізуються в мембрані, мають двосмугову форму спектра флуоресценції і набагато більшу інтенсивність у порівнянні з молекулами ФМЄ, які знаходяться у розчині. Це дозволяє відрізняти сигнали флуоресценції ФМЄ, який знаходиться в мембранах та поза мембранами (у водному чи воднокріопротекторному середовищі). Використання флуоресцентного зонда ФМЄ і відношення інтенсивностей його смуг флуоресценції FA до FБ для визначення мембранотропної активності КП дозволяє: - підвищити чутливість способу за рахунок використання на порядок більш низької (10-6М), у порівнянні з методом ЕПР, концентрації флуоресцентного зонда; - поліпшити інтерпретацію результатів за рахунок того, що флуоресценцію ФМЄ можна спостерігати майже цілком з мембран, а в водному чи водно-кріопротекторному розчині вона незначна і не заважає аналізу спектральних даних; - скоротити час вимірювань до 1хв. і знизити трудомісткість методу за рахунок зміни зонда, способу реєстрації спектрів, спрощення процедури підготовки зразка і математичної обробки результатів у порівнянні з методом ЕПР, а також за рахунок використання одного зонда, чутливого до структурних змін як поверхневої, так і неполярної областей мембрани; знизити вартість визначення за рахунок використання флуоресцентного зонда, вартість якого на 3 порядки нижче за вартість ЕПР-зондів. Так, наприклад, вартість зонда ФМЕ становить біля $5 за 1г, вартість флуоресцентного зонда флуоресцеін діацетату (номер за каталогом F7378) складає $3.88 за 1г [9], тоді як вартість поширеного мембранного ЕПР-зонду 5-доксил стеаринової кислоти (номер за каталогом 25,363-4), складає $50600 за 1г [10]. Спосіб здійснюють таким чином. Флуоресцентний зонд ФМЄ, у вигляді спиртового розчину з початковою концентрацією 5x10-40,5x10-3М, додають в кількості 2-10мкл до 2-3мл суспензії штучних або природних мембран (які не містять КП). Кінцева концентрація зонда в суспензії мембран становить при цьому 0,5-5x10-6М. Після 10-15хв. інкубації суспензії мембран з зондом реєструють його спектр флуоресценції, обравши довжину хвилі збудження в області 380-440нм. З отриманого спектру флуоресценції знаходять значення інтенсивностей FА і FБ, які виміряють на довжинах хвиль А і Б, де А заходиться в межах 480535нм, а Б знаходиться в межах 540-650нм і обчислюють відношення FА/FБ. Аналогічні вимірювання виконують для зразків суспензії мембран, які додатково вміщують різні концентрації КП. По знайденим значенням інтенсивностей флуоресценції будують залежність FA/FБ від концентрації КП і за зростанням нахилу графіка у бік осі ординат у по 13838 6 рівнянні з контролем судять про мембранотропну активність КП. Приклад 1 Флуоресцентний зонд ФМЄ розчиняли в ети-3 ловому спирті до концентрації 3x10 М. 10мкл спиртового розчину ФМЕ додавали до 2,0мл суспензії ліпосом, приготованих з яєчного фосфатиділхоліну (з вмістом ліпідів 2,0мг/мл), інкубували 10хв. і реєстрували спектр флуоресценції зонда в області 410-650нм на спектрофлуориметрі Varian Сагу Eclipse (США) при ширині щілин монохроматорів збудження і флуоресценції 5 і 5нм, відповідно, та довжині хвилі збудження 405нм. Після цього з отриманого спектру знаходили максимуми флуоресценції зонда на довжинах хвиль А і Б, які обирали при 515 і 575нм, відповідно. Обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції F515/F575. Воно дорівнювало 0,57. Аналогічні виміри проводили для зразків мембран, які крім ФМЕ вміщували 5, 10, 20, 30 і 40 об. % диметілсульфоксіду (ДМСО). За знайденими значеннями інтенсивностей флуоресценції ФМЕ при 515 і 575нм будували залежність відношення F515/F575 від концентрації ДМСО і по різкому нахилу графіка в бік осі ординат визначали початкову концентрацію ДМСО, яка спричиняє порушення упаковки мембран. Вона становила 12 об. %. Приклад 2 Флуоресцентний зонд ФМЕ розчиняли в етанолі до концентрації 3,5x10-3М. 10мкл спиртового розчину ФМЕ додавали до 2,0мл суспензії ліпосом, приготованих з сумарних ліпідів сперматозоїдів півня (з вмістом ліпідів 1,0мг/мл), інкубували 15хв. і реєстрували спектр флуоресценції зонда, як описано в прикладі 1. Визначали відношення інтенсивностей флуоресценції зонда на довжинах хвиль А і Б, які обирали при 515 і 575нм, відповідно. Відношення F515/F575 становило 0,57. Аналогічні вимірювання проводили для зразків, що вміщують, крім ФМЕ, 5, 10, 20, 30 і 40 об.% диметілформаміду (ДМФА). За визначеними значеннями інтенсивностей флуоресценції будували графік залежності F515/F575 від концентрації ДМФА і за різким нахилом графіка в бік осі ординат визначали початкову концентрацію ДМФА, яка спричиняє порушення упаковки мембран. Вона становила 7,5 об. %. Приклад 3 Флуоресцентний зонд ФМЄ розчиняли в етанолі до концентрації 0,7x10-3М. 20мкл спиртового розчину ФМЄ додавали до 2,0мл суспензії мікросомальних мембран, вилучених з печінки щура (вміст загального білка в зразках становив 0,75мг/мл), інкубували 15хв. і реєстрували спектр флуоресценції зонда, як описано в прикладі 1. Обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції зонда на довжинах хвиль А і Б, які обирали при 515 і 575нм, відповідно. Воно становило 0,45. Аналогічні вимірювання виконували для зразків, які вміщували, крім ФМЕ, також 5, 10, 20, 30 і 40 об.% ДМСО. За знайденими значеннями інтенсивностей флуоресценції будували графік залежності відношення F515/F575 від концентрації ДМСО і за різкою зміною нахилу кривої в бік осі ординат визначали концентрацію ДМСО, яка спричиняє 7 13838 порушення упаковки мікросомальних мембран. Вона становила 12 об. %. Джерела інформації: 1. Иванов И.Т. Сравнение механизмов кислотного и щелочного гемолиза эритроцитов человека // Биофизика. - 2001. - Т. 46, вып. 2. - С. 281-290. 2. Черницкий Е.Б., Сенькович О.Б., Козлова Н.М. Гетерогенность пор, образуемых в мембране эритроцитов липофильными гемолитиками // Биофизика, - 1996, Т. 41, вып. 6. - С. 1270-1275. 3. Бондаренко В.А., Коптелов В.А., Лежанин С.Н., Олейник О.А., Рамазанов В.В., Середа Т.П. Зависимость интенсивности транспорта флуоресцеина от температуры среды // Проблемы криобиологии. - 2001. - №1. - С. 3-7. 4. Пат. №14072, Україна, G01N 24/10, 1997. 5. Иванов Л.В., Ляпунов Н.А., Цымбал Л.В. и др. Влияние состава двухкомпонентных растворителей на биологические мембраны // Хим.-фарм. журнал. - 1988. - №1. - С. 1437-1443. 6. Цымбал Л.В., Нардид Я.О. Проницаемость Комп’ютерна верстка А. Крулевський 8 мембран эритроцитов, модифицированных высокими температурами и сульфгидрильными реагентами Актуальные проблемы медицины и биологии // Сб. научн. тр., Киев, 2004. - С. 185-189. 7. Sengupta P.К., and Kasha M. Excited state proton-transfer spectroscopy of 3-hydroxyflavone and querceim // Chem. Phys. Lett. - 1979. - Vol. 68. - №23. - P. 382-385. 8. Pivovarenko V.G., Tuganova A.V., Klymchenko A.S., Demchenko. A.P. Flavonols as models for fluorescent membrane probes. 1. The response to the charge of micelles// Cellular & Molecular Biology Letters. - 1997. - No 2. - P. 355364. 9. Каталог «Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук» (Sigma), 1999. С. 2196. 10. Каталог «Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук» (Sigma), 1999. С. 451. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601