Спосіб виявлення генотоксичної і цитотоксичної дії антигельмінтиків

Номер патенту: 14610

Опубліковано: 15.05.2006

Автор: Стибель Володимир Володимирович

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб виявлення генотоксичної і цитотоксичної дії антигельмінтиків, що включає використання біологічного тест-об'єкта, культивування його з різними дозами досліджуваного препарату та аналіз мазків з матеріалів тест-об'єкта, який відрізняється тим, що  як тест-об'єкти використовують клітини кісткового мозку мишей і лімфоцити крові свиней, з яких готують клітинні суспензії та проводять лужний гель-електрофорез поодиноких клітин тест-об'єктів і визначають на мікропрепаратах пошкодження ДНК в клітинах тест-об'єктів, та за наявністю пошкодження ДНК в клітинах тест-об'єктів на мікропрепаратах судять про генотоксичну і цитотоксичну дію досліджуваних антигельмінтиків.

Текст

Спосіб виявлення генотоксичної і цитотоксичної дії антигельмінтиків, що включає використання біологічного тест-об'єкта, культивування його з різними дозами досліджуваного препарату та ана 3 тують клітинні суспензії та проводять лужний електрофорез поодиноких клітин кісткового мозку мишей та лімфоцитів крові свиней і визначають на мікропрепаратах пошкодження ДНК в клітинах тест-об'єктів. Облік пошкоджень молекули ДНК, які є наслідком дії генотоксичних чинників середовища у прокаріот і еукаріот, проводять за допомогою методів оцінки цілісності двонитчатої полімерної структури ДНК, реєстрації модифікованих основ ДНК, обліку позначених основ, що включені у макромолекули при репарації пошкоджень. Найбільш сучасним, перспективним чутливим методом виявлення первинних пошкоджень молекули ДНК окремих клітин при дії чинників навколишнього середовища вважається гельелектрофорез поодиноких клітин - „Comet assay” або метод „ДНК-комет” [Kassie F., Parxefall W., Knasmuller S. Single cell gel electrophoresis: a new technique for human biomonitoring studies // Mutat. Res. Rev. in Mutat. Res. - 2000. - Vol.463. - P.13-31]. Після лізису і електрофорезу проникних у агарозний шар еукаріотичних клітин пошкоджена ДНК мігрує в електричному полі у напрямку до анода, утворюючи структуру, схожу на комету, в якій виділяється „голова” і „хвіст”. Інтерпретація результатів заснована на гіпотезі, що викликані генотоксичними чинниками пошкодження ДНК ядра складаються з низькомолекулярних ділянок, розривів, репараційно-вирізаних пошкоджень і кислотно-лабільних ділянок ДНК. В результаті лізису звільнені з ядра клітин пошкоджені ділянки ДНК при електрофорезі формують „хвіст комети”, а непошкоджені - „голову комети”. Метод „ДНКкомет” має широкі можливості оцінки пошкоджень, що викликаються генотоксичними чинниками в соматичних клітинах, оскільки може проводитися в гомогенізуючих тканинах шлунка, кишечника, печінки, нирок, легень, селезінки, сечового міхура, кісткового мозку. Отже заявлений спосіб забезпечує виявлення росту одноланцюгових розривів, лужно-лабільних сайтів ядерної молекули ДНК, а також росту апоптотичних клітин кісткового мозку мишей і лімфоцитів крові свиней in vitro, що свідчить про наявність (або відсутність) генотоксичної і цитотоксичної дії досліджуваних антигельмінтиків. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: 1. Готують стерильні розчини різних доз досліджуваного препарату - антигельмінтика. 2. Одержують і обробляють тест-об'єкти: 2.1. Для одержання клітин кісткового мозку: 2.1.1. Мишам-самцям після 2-х тижневого карантину вводять перорально через металічний зонд різні дози досліджуваного антигельмінтика протягом 7 діб. 2.1.2. Через добу після останнього введення досліджуваного антигельмінтика мишей декапітують, вилучають стегнові кістки і за допомогою шприца з середовищем RPMI-1640 вимивають кістковий мозок та готують клітинну суспензію кісткового мозку мишей, яку розводять середовищем RPMI-1640 до концентрації клітин 1-5х106 клітин у 1мл. 14610 4 2.2. Одержання лімфоцитів крові від поросят віком 2-4 місяці. 2.2.1. Відбирають кров у флакони з додаванням гепарину; у контрольні флакони вносять стерильний розчин фізрозчину, а в решту дослідних різні дози стерильного розчину досліджуваного антигельмінтика і культивують 24 години при t +37°С. 2.2.2. Одержують клітинну суспензію лімфоцитів крові свиней центрифугуванням гепаринізованої крові з наступним видаленням і відмиванням клітин і ресуспендуванням в середовищі RPMI1640 з повторним видаленням супернатанту. Осад клітин лімфоцитів крові розводять середовищем RPMI-1640 до концентрації 1-5х106 клітин у 1 мл. 3. Проводять лужний гель - електрофорез поодиноких клітин виготовлених суспензій тестоб'єктів за [Singh N., McCoy M., Tice R., Schneider E. A Simple Technique for quantification of low levels of DNA damage in individual cells // Exp. Cell Research. - 1988. - Vol.175. - P.184-191]. У модифікації [Hellman В., VaghefH., Friis L., Ediing C. Alkaline single cell gel electrophoresis of DNA fragments in biomonitoring for genotoxicity: an introductory study on healthy human volunteers // Int. Arch. Occup. Environ. Health. - 1997. - Vol.69. P.185-192]. 4. Аналіз мікропрепаратів проводять на люмінесцентному мікроскопі за встановленими світлофільтрами (546нм) і таким, що відрізає (590нм) люмінесценцію. Зображення комет на мікропрепаратах фотографують за допомогою цифрової фотокамери „Nikon Coolpix-4500”. З кожного мікропрепарату одержують від 20 до 30 цифрових зображень. Облік пошкоджень молекули ДНК проводять шляхом аналізу цифрових зображень автоматичною програмою „CASP v.1.2.2”, розробленою співробітниками Вроцлавського університету і інституту теоретичної фізики Польщі в 2003p. [Konca K., Lankoff A., Banasik A. e.a. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay // Mutat. Res. Genetic Toxicol. and Envir. Mutagenesis. - 2003. - Vol.534. - P.15-20]. 3 кожного мікропрепарату підраховують по 50 клітин, в кожній з яких враховують відсотки ДНК в „голові” і „хвості” комети, довжина „комет” і „хвостів комет”. Як основні міжнародно прийняті показники генотоксичної дії чинників середовища використовують „момент хвоста” („довжина хвоста”, помножена на відсоток ДНК в „хвості”) і „момент хвоста Olive” (відсоток ДНК в „хвості”, помножений на відстань між центрами максимальної концентрації ДНК в „голові” і „хвості комети”). Для оцінки цитотоксичної дії препаратів на клітини кісткового мозку мишей і лімфоцити свиней в 100 випадково вибраних клітках визначають відсоток апоптотичних, зображення яких характеризують мінімальні розміри ядра і розкиданий на всі боки великий хвіст. Приклад конкретного виконання способу. Ефективність заявленого способу і його перевага перед прототипом підтверджена виявленням генотоксичної і цитотоксичної дії препарату „Бровермектин-гранулят” (реєстраційне посвідчення №1151-02-386-05). Препарат розрахований для 5 групового застосування в свинарських і птахівничих господарствах. За зовнішнім виглядом - це мікрогранульований порошок з діаметром мікрогранул 2-4мкр, світло-жовтого кольору, без запаху, приємного солодкуватого смаку. В одному грамі грануляту міститься: івермектин (діюча основа) 3,5мг, токоферол ацетат (допоміжна складова) 20мг, інші фармакопейні компоненти (формуючі та стабілізуючі гранули) - до 1000мг. Матеріалом для дослідження були: миші-самці лінії СВА 4-5-ти місячного віку масою тіла 18-20г у кількості 40 особин, а також поросята 2-3-и місячного віку. За два тижні до початку дослідження піддослідні тварини підлягали карантинуванню і утримувалися на стандартному раціоні в сухому приміщенні з штучним освітленням. Для вивчення генотоксичних і цитотоксичних властивостей препаратів виконано 2 серії дослідів. Перша проведена на піддослідних тваринах, друга - на крові свиней in vitro. У першій серії досліджували генотоксичну і цитотоксичну дію препарату на клітини кісткового мозку мишей методом лужного гельелектрофорезу поодиноких клітин залежно від дози введеного препарату. Дослідження проведені на 40 мишах, які були розподілені на 4 групи по 10 особини у кожній. Мишам першої, групи вводили перорально за допомогою металевого зонду препарат бровермектин-гранулят, розведений у 2%ному крохмальному гелі протягом 7 діб у дозі 0,1г/кг, другої - 0,2г/кг і третьої - 0,3г/кг. Контрольній групі - вводили 2%-ний крохмальний гель у еквівалентних дозах. Зміни рівнів одноланцюгових розривів, лужно-лабільних сайтів, апоптотичних клітин кісткового мозку враховувалися через одну добу від останнього введення. У другій серії дослідів вивчали можливі генотоксичні та цитотоксичні ефекти препарату на лімфоцитах крові свиней при їх сумісній культивації in vitro методом лужного гель-електрофорезу поодиноких клітин. Дослідження проведені на крові 5ти поросятах. Від кожної тварини для досліджень відбирали у флакони по 5мл кров (перший для контролю, інші - дослідні). У дослідні флакони додавали препарат бровермектин-гранулят у концентрації 0,2г/кг культурального вмісту. У контрольні проби вносився стерильний 0,9%-ний розчин на 14610 6 трію хлориду в тому ж об'ємі, що і розведені препарати. Зміни рівнів одноланцюгових розривів, лужнолабільних сайтів і відсотків апоптотичних клітин проводили через 24 години культивації. Метод лужного гель-електрофорезу поодиноких клітин проводили на суспензіях клітин кісткового мозку мишей і лімфоцитів свиней. Метод дозволяє визначити рівні одноланцюгових відривів, лужно-лабільних сайтів молекули ДНК при дії генотоксичних чинників і рівнів апоптозу клітин. Результатами досліджень встановлено, що при проведенні методу ДНК-комет в клітинах кісткового мозку контрольних тварин протягом досліду, відсоток ДНК у „голові комети” склав 98,36±0,32, відсоток ДНК у „хвостах комет” 1,64±0,32, довжина „хвостів комет” у пікселях 5,02±0,36, довжина „комет” в пікселях - 46,00±1,20, „момент хвоста” - 0,19±0,09, „момент хвоста Olive” - 0,33±0,08, відсоток апоптотичних клітин 1,40±1,35 (табл.1.). За введення препарату у дозі 0,1г/кг відсоток ДНК у „голові комети” дещо знижувався і склав 97,35±0,79, відсоток ДНК у „хвостах комет” був у 1,6 разів більшим від контрольного показника (Р

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for detecting genotoxic and cytotoxic action of antihelminthics

Автори англійською

Stybel Volodymyr Volodymyrovych

Назва патенту російською

Способ обнаружения генотоксического и цитотоксического действия антигельминтиков

Автори російською

Стибель Владимир Владимирович

МПК / Мітки

МПК: G01N 33/15, C12Q 1/00, C12R 1/91, A61P 33/00

Мітки: генотоксичної, цитотоксичної, спосіб, виявлення, антигельмінтиків, дії

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/4-14610-sposib-viyavlennya-genotoksichno-i-citotoksichno-di-antigelmintikiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виявлення генотоксичної і цитотоксичної дії антигельмінтиків</a>

Подібні патенти