Спосіб виявлення генотоксичної і цитотоксичної дії антигельмінтиків
Формула / Реферат
Спосіб виявлення генотоксичної і цитотоксичної дії антигельмінтиків, що включає використання біологічного тест-об'єкта, культивування його з різними дозами досліджуваного препарату та аналіз мазків з матеріалів тест-об'єкта, який відрізняється тим, що як тест-об'єкти використовують клітини кісткового мозку мишей і лімфоцити крові свиней, з яких готують клітинні суспензії та проводять лужний гель-електрофорез поодиноких клітин тест-об'єктів і визначають на мікропрепаратах пошкодження ДНК в клітинах тест-об'єктів, та за наявністю пошкодження ДНК в клітинах тест-об'єктів на мікропрепаратах судять про генотоксичну і цитотоксичну дію досліджуваних антигельмінтиків.
Текст
Спосіб виявлення генотоксичної і цитотоксичної дії антигельмінтиків, що включає використання біологічного тест-об'єкта, культивування його з різними дозами досліджуваного препарату та ана 3 тують клітинні суспензії та проводять лужний електрофорез поодиноких клітин кісткового мозку мишей та лімфоцитів крові свиней і визначають на мікропрепаратах пошкодження ДНК в клітинах тест-об'єктів. Облік пошкоджень молекули ДНК, які є наслідком дії генотоксичних чинників середовища у прокаріот і еукаріот, проводять за допомогою методів оцінки цілісності двонитчатої полімерної структури ДНК, реєстрації модифікованих основ ДНК, обліку позначених основ, що включені у макромолекули при репарації пошкоджень. Найбільш сучасним, перспективним чутливим методом виявлення первинних пошкоджень молекули ДНК окремих клітин при дії чинників навколишнього середовища вважається гельелектрофорез поодиноких клітин - „Comet assay” або метод „ДНК-комет” [Kassie F., Parxefall W., Knasmuller S. Single cell gel electrophoresis: a new technique for human biomonitoring studies // Mutat. Res. Rev. in Mutat. Res. - 2000. - Vol.463. - P.13-31]. Після лізису і електрофорезу проникних у агарозний шар еукаріотичних клітин пошкоджена ДНК мігрує в електричному полі у напрямку до анода, утворюючи структуру, схожу на комету, в якій виділяється „голова” і „хвіст”. Інтерпретація результатів заснована на гіпотезі, що викликані генотоксичними чинниками пошкодження ДНК ядра складаються з низькомолекулярних ділянок, розривів, репараційно-вирізаних пошкоджень і кислотно-лабільних ділянок ДНК. В результаті лізису звільнені з ядра клітин пошкоджені ділянки ДНК при електрофорезі формують „хвіст комети”, а непошкоджені - „голову комети”. Метод „ДНКкомет” має широкі можливості оцінки пошкоджень, що викликаються генотоксичними чинниками в соматичних клітинах, оскільки може проводитися в гомогенізуючих тканинах шлунка, кишечника, печінки, нирок, легень, селезінки, сечового міхура, кісткового мозку. Отже заявлений спосіб забезпечує виявлення росту одноланцюгових розривів, лужно-лабільних сайтів ядерної молекули ДНК, а також росту апоптотичних клітин кісткового мозку мишей і лімфоцитів крові свиней in vitro, що свідчить про наявність (або відсутність) генотоксичної і цитотоксичної дії досліджуваних антигельмінтиків. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: 1. Готують стерильні розчини різних доз досліджуваного препарату - антигельмінтика. 2. Одержують і обробляють тест-об'єкти: 2.1. Для одержання клітин кісткового мозку: 2.1.1. Мишам-самцям після 2-х тижневого карантину вводять перорально через металічний зонд різні дози досліджуваного антигельмінтика протягом 7 діб. 2.1.2. Через добу після останнього введення досліджуваного антигельмінтика мишей декапітують, вилучають стегнові кістки і за допомогою шприца з середовищем RPMI-1640 вимивають кістковий мозок та готують клітинну суспензію кісткового мозку мишей, яку розводять середовищем RPMI-1640 до концентрації клітин 1-5х106 клітин у 1мл. 14610 4 2.2. Одержання лімфоцитів крові від поросят віком 2-4 місяці. 2.2.1. Відбирають кров у флакони з додаванням гепарину; у контрольні флакони вносять стерильний розчин фізрозчину, а в решту дослідних різні дози стерильного розчину досліджуваного антигельмінтика і культивують 24 години при t +37°С. 2.2.2. Одержують клітинну суспензію лімфоцитів крові свиней центрифугуванням гепаринізованої крові з наступним видаленням і відмиванням клітин і ресуспендуванням в середовищі RPMI1640 з повторним видаленням супернатанту. Осад клітин лімфоцитів крові розводять середовищем RPMI-1640 до концентрації 1-5х106 клітин у 1 мл. 3. Проводять лужний гель - електрофорез поодиноких клітин виготовлених суспензій тестоб'єктів за [Singh N., McCoy M., Tice R., Schneider E. A Simple Technique for quantification of low levels of DNA damage in individual cells // Exp. Cell Research. - 1988. - Vol.175. - P.184-191]. У модифікації [Hellman В., VaghefH., Friis L., Ediing C. Alkaline single cell gel electrophoresis of DNA fragments in biomonitoring for genotoxicity: an introductory study on healthy human volunteers // Int. Arch. Occup. Environ. Health. - 1997. - Vol.69. P.185-192]. 4. Аналіз мікропрепаратів проводять на люмінесцентному мікроскопі за встановленими світлофільтрами (546нм) і таким, що відрізає (590нм) люмінесценцію. Зображення комет на мікропрепаратах фотографують за допомогою цифрової фотокамери „Nikon Coolpix-4500”. З кожного мікропрепарату одержують від 20 до 30 цифрових зображень. Облік пошкоджень молекули ДНК проводять шляхом аналізу цифрових зображень автоматичною програмою „CASP v.1.2.2”, розробленою співробітниками Вроцлавського університету і інституту теоретичної фізики Польщі в 2003p. [Konca K., Lankoff A., Banasik A. e.a. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay // Mutat. Res. Genetic Toxicol. and Envir. Mutagenesis. - 2003. - Vol.534. - P.15-20]. 3 кожного мікропрепарату підраховують по 50 клітин, в кожній з яких враховують відсотки ДНК в „голові” і „хвості” комети, довжина „комет” і „хвостів комет”. Як основні міжнародно прийняті показники генотоксичної дії чинників середовища використовують „момент хвоста” („довжина хвоста”, помножена на відсоток ДНК в „хвості”) і „момент хвоста Olive” (відсоток ДНК в „хвості”, помножений на відстань між центрами максимальної концентрації ДНК в „голові” і „хвості комети”). Для оцінки цитотоксичної дії препаратів на клітини кісткового мозку мишей і лімфоцити свиней в 100 випадково вибраних клітках визначають відсоток апоптотичних, зображення яких характеризують мінімальні розміри ядра і розкиданий на всі боки великий хвіст. Приклад конкретного виконання способу. Ефективність заявленого способу і його перевага перед прототипом підтверджена виявленням генотоксичної і цитотоксичної дії препарату „Бровермектин-гранулят” (реєстраційне посвідчення №1151-02-386-05). Препарат розрахований для 5 групового застосування в свинарських і птахівничих господарствах. За зовнішнім виглядом - це мікрогранульований порошок з діаметром мікрогранул 2-4мкр, світло-жовтого кольору, без запаху, приємного солодкуватого смаку. В одному грамі грануляту міститься: івермектин (діюча основа) 3,5мг, токоферол ацетат (допоміжна складова) 20мг, інші фармакопейні компоненти (формуючі та стабілізуючі гранули) - до 1000мг. Матеріалом для дослідження були: миші-самці лінії СВА 4-5-ти місячного віку масою тіла 18-20г у кількості 40 особин, а також поросята 2-3-и місячного віку. За два тижні до початку дослідження піддослідні тварини підлягали карантинуванню і утримувалися на стандартному раціоні в сухому приміщенні з штучним освітленням. Для вивчення генотоксичних і цитотоксичних властивостей препаратів виконано 2 серії дослідів. Перша проведена на піддослідних тваринах, друга - на крові свиней in vitro. У першій серії досліджували генотоксичну і цитотоксичну дію препарату на клітини кісткового мозку мишей методом лужного гельелектрофорезу поодиноких клітин залежно від дози введеного препарату. Дослідження проведені на 40 мишах, які були розподілені на 4 групи по 10 особини у кожній. Мишам першої, групи вводили перорально за допомогою металевого зонду препарат бровермектин-гранулят, розведений у 2%ному крохмальному гелі протягом 7 діб у дозі 0,1г/кг, другої - 0,2г/кг і третьої - 0,3г/кг. Контрольній групі - вводили 2%-ний крохмальний гель у еквівалентних дозах. Зміни рівнів одноланцюгових розривів, лужно-лабільних сайтів, апоптотичних клітин кісткового мозку враховувалися через одну добу від останнього введення. У другій серії дослідів вивчали можливі генотоксичні та цитотоксичні ефекти препарату на лімфоцитах крові свиней при їх сумісній культивації in vitro методом лужного гель-електрофорезу поодиноких клітин. Дослідження проведені на крові 5ти поросятах. Від кожної тварини для досліджень відбирали у флакони по 5мл кров (перший для контролю, інші - дослідні). У дослідні флакони додавали препарат бровермектин-гранулят у концентрації 0,2г/кг культурального вмісту. У контрольні проби вносився стерильний 0,9%-ний розчин на 14610 6 трію хлориду в тому ж об'ємі, що і розведені препарати. Зміни рівнів одноланцюгових розривів, лужнолабільних сайтів і відсотків апоптотичних клітин проводили через 24 години культивації. Метод лужного гель-електрофорезу поодиноких клітин проводили на суспензіях клітин кісткового мозку мишей і лімфоцитів свиней. Метод дозволяє визначити рівні одноланцюгових відривів, лужно-лабільних сайтів молекули ДНК при дії генотоксичних чинників і рівнів апоптозу клітин. Результатами досліджень встановлено, що при проведенні методу ДНК-комет в клітинах кісткового мозку контрольних тварин протягом досліду, відсоток ДНК у „голові комети” склав 98,36±0,32, відсоток ДНК у „хвостах комет” 1,64±0,32, довжина „хвостів комет” у пікселях 5,02±0,36, довжина „комет” в пікселях - 46,00±1,20, „момент хвоста” - 0,19±0,09, „момент хвоста Olive” - 0,33±0,08, відсоток апоптотичних клітин 1,40±1,35 (табл.1.). За введення препарату у дозі 0,1г/кг відсоток ДНК у „голові комети” дещо знижувався і склав 97,35±0,79, відсоток ДНК у „хвостах комет” був у 1,6 разів більшим від контрольного показника (Р
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for detecting genotoxic and cytotoxic action of antihelminthics
Автори англійськоюStybel Volodymyr Volodymyrovych
Назва патенту російськоюСпособ обнаружения генотоксического и цитотоксического действия антигельминтиков
Автори російськоюСтибель Владимир Владимирович
МПК / Мітки
МПК: G01N 33/15, C12Q 1/00, C12R 1/91, A61P 33/00
Мітки: генотоксичної, цитотоксичної, спосіб, виявлення, антигельмінтиків, дії
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/4-14610-sposib-viyavlennya-genotoksichno-i-citotoksichno-di-antigelmintikiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виявлення генотоксичної і цитотоксичної дії антигельмінтиків</a>
Попередній патент: Спосіб сумісного визначення іонів тербію, диспрозію, європію і самарію в імунофлуоресцентному аналізі
Наступний патент: Спосіб боротьби зі стресом
Випадковий патент: Схват маніпулятора