Спосіб підготовки сперми тварин до штучного осіменіння

Изобретение относит ся к искусственному осеменению животных. Цель изо бретения - повышение жизнеспособности спермиев в процессе замораживания. Способ заключается в том, что сперму разбавляют сначала изотонической, а затем гипертонической средами. Объемы сред для разбавления определяют по специальным расчетным формулам. Разбавленную сперму рчсфасовывают в герметичные упаковки, содержащие ячейки, соединенные между собой капиллярными трубками. Заполненные и загерметизи- • рованные упаковки маркируют. Сперму охлаждают и эквилибрируют. Затем сперму замораживают. Перед оттаиванием сперму отогревают до минус 80~70 С. ! ил. С Изобретение относится к искусственному осеменению животных. Цель изобретения - повышение жизнеспособности спермиев в процессе замораживания. Пример обработки спермы быков. Полученную сперму от быков-ПЦОИЗводителей оценивают по внешнему виду, зала-, ху, подвижности, концентрации и объему, а затем разбавляют изотонической лактозной средой, состоящей из воды дистиллированной 100 мл,лактозы 9,7 г и гипертонической средой с криопротектором такого рецепта: вод а дистиллированная 100 мл, лактоза 15,3 г, глицерин 6,4 мл, желток свежего куриного яйца 20 мл и спермосан-3 50 тыс.ед. Для гипертонической среды двухкратное' разбавление, установленное экспериментальным путем по подвижности и вы38-89 живаемости спермиев при 38°Св является оптимальным. Объем сред для разбавления определяется по формулам СЛ ° где О Г объем гипертонической среды с криопротектором, мл; 0 э - объем эякулята, мл; К - концентрация всех клеток в эякуляте, млрд/мл; количество подвижных спермиП ев в сперме, выраженное в д е сятых долях единицы; - установленный исследователем или указанный директивными | документами объем д о з , на ко 515442 канала 2 (уровень заполнения обознаторые спедует разделить весь чают меткой) со вставленной прямой объем разбавленной клеточной иглой заполняют разбавленной спермой суспензии, мл; при вертикальном положении упаковки. P — характерная для гипертоничесЗатем упаковку кладут на ровный, гокой среды с криопротектором ризонтальный стол и через Г-образную оптимальная для жизнеспособтрубку вдувают стерильный воздух. Возности спермиев кратность раздух выдавливает из каналов и верхних бавления спермы; частей заполненных ячеек сперму в пустребуемое количество подвиж 10 тые ячейки, заполняет их и во всех ных спермиев в дозе, млрд; ячейках образуется воздушное прост°«с~ объем изотонической среды, Ґ ранство, равное диаметру соединительП р и м е р 1. Получен эякулят ных каналов 4. объемом 5 мл, подвижностью 0,8 баллов, концентрацией 1,8 млрд/мл. Сперму сле-]5 Расфасованную сперму в каждой ячейдует разбавить и заморозить в гермеке герметизируют путем точечной тертичных упаковках из расчета получения мической сварки межъячеистых каналов. в дозе оттаянной спермы объемом 0,2 мм Заполненные и загерметизированные 15 млн подвижных спермиев. упаковки маркируют. Каждую промаркиЗаранее по формулам (і) и (2) G O - 20 рованную упаковку помещают в ватноставлягот рабочую таблицу, согласно комарлевый и поролоновый пакет, имеюторой на пересечении графы объема эящей комнатную ( 18-20^) температуру кулята 5 мл и строки концентрации и помещают на полки холодильника спермиев 1,8 млрд/мл находим, что для (2-4 fi). В холодильнике охлаждают и разбавления полученного эякулята не- 25 эквилибрируют сперму в течение 4-6 ч. обходимо взять 18,5 мл изотонической Из холодильника вынимают упаковки среды и 23,5 мл гипертонической среды со спермой, перемешивают ее путем изс криопротектором. менения положения упаковок в течение нескольких секунд, переносят в храниК св.ежевзятой сперме непосредственно в спермоприемник добавляют изото- 30 лище биопродуктов и кладут на медный щит, находящийся в парах азота. Тем- • * ническую среду, а затем гипертоничеспература щита минус 120-130°С, Через кую среду с криопротектором и другими 8-10 с постукиванием по упаковкам, особо важными веществами в количествибрацией, встряхиванием, или другим вах, приведенных в таблице. Допустиспособом вызывают принудительную крисмо разбавление спермы смесью двух _- таллизацию биообъекта в каналах упа, сред. ковки. Разбавленную сперму выдерживают 58 мин при комнатной температуре, заПромежуток времени с момента пометем снова осторожно и тщательно перещения упаковок в хладоагент до моменмешивают и расфасовывают в герметич- t та принудительного вызова кристаллизаные упаковки. ции устанавливают экспериментальным Для заполнения ячеек 1 спермой один путем. Он зависит от величины спермоизобщих каналов 2 и уплотнительную дозы, диаметра межъячеистых каналов, вставку 3 прокалывают Г-образной трубматериала, из которых изготовлены упакой (согнутой длинной иглой от медиковки и температуры замораживания. 45 цинского шприца), а второй общий каПосле вызова кристаллизации в ячейнал 2 и уплотнительную вставку прокаках сперму выдерживают на щите 8лывают с противоположного края прямой 10 мин, а затем упаковки погружают в тонкой иглой от медицинского шприца. жидкий азот. К Г-образиой трубке присоединяют спер Из жидкого азота извлекают одну или 50 несколько спермодоз, помещают с помомоприемник или шприц с разбавленной спермой для ее расфасовки в ячейки щью специального приспособления в па.упаковки. Вторая прямая игла служит ры азота сосуда Дьюара и отогревают для выхода воздуха из ячеек при их за1 сперму до минус 8О-70°С. Температуру ' полнении клеточной суспензией. Пуконтролируют жидкостным термометром Ї или термопарой. Отогретую сперму с 5 тем несильного надавливания на поршень ширина или спермоприемник ячейки помощью приспособления для отогрева в каждом ряду, за исключением одной, переносят в водяную баню при 40°С и двух или нескольких, у второго общего оттаивают 15-20 с. н 5 ' 1515442 и з о б р е т е н и я Ф о р м у л а Способ подготовки спермы животный искусственному осеменению, включающий разбавление спермы изотонической и ги _5 пертонической средами с последующей дозировкой, расфасовкой и маркировкой разбавленной спермы, замораживание и оттаивание, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения жиз- 10 неспособности спермиев в процессе за мораживания, в качестве изотонической среды используют среду, содержащую (мас.%) лактозу 9,7 г и воду дистиллированную остальное, в качестве ги- 15 пертонической среды используют среду, содержащую лактозу 15,3 г, глицерин 6,4 мл, желток куриного яйца 20 мл, спермосан 3-50 тыс.ед. и воду дистил20 лированную остальное, а объемы сред для разбавления определяют по формулам ot = Н • Р, и Po- где О гс объем гипертонической среды с криопротектором, мл; 0 э ~ объем'эякулята, мл; К - концентрация всех клеток в эякуляте, млрд/мл; П - количество подвижных спермиев в сперме, выраженное в десятых долях единицы;, установленный исследователем или указанный директивными документами объем дозы, на которые следует разделить весь объем разбавленной клеточной суспензии, мл; характерная для гипертонической среды с криопротектором оптимальная для жизнеспособ-. ности спермиев кратность разбавления спермы, установленная экспериментальным путем на основании биоконтроля по подвижности, выживаемости (ч), абсолютному показателю выживаемости спермиев в разбавленной и замороженно-оттаянной сперме; Н - требуемое, директивными доку ментами или установленное исследователем количество по25 движных спермиев в дозе, млрд; . . объем изотонической среды, ° с мл; н 30 а расфасовку, замораживание и оттаивание спермы осуществляют в упаковках, содержащих ячейки, соединенные между собой капиллярными трубками, причем перед оттаиванием сперму отогревают до температуры минус 80-70°С. Редактор С. Рекова Составитель Д. Филиппова Техред М.Моргентал Корректоре. Шекмар Заказ 192О/ДСП Тираж 356 • Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35-, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 Ч' V' V' І/ 1