Спосіб регенерації адвентивних мікропагонів hyssopus officinalis l. в умовах in vitro

Спосіб регенерації адвентивних мікропагонів Hyssopus officinalis L. в умовах in vitro, що включає 3 68595 4 Зеатин, мкМ 2,28 і культивування експлантів на живильному сереТидіазурон, мкМ 4,0-7,0 довищі, що містить половинну концентрацію макро Кінетин, мкМ 4,6 - і мікросолей, вітаміни за прописом МС і фітогорІМК, мкМ 0,49 8,0-11,0 мони, відповідно до винаходу в живильне середоСахароза, мг/л 30000,0 30000,0 15000,0 вище як фітогормон вводять речовину цитокініноАгар, мг/л 6000,0 6000,0 6000,0 рH 5,6 5,6 5,6 вого типу дії, листкові експланти гісопу відбирають з мікропагонів після 4-5 пасажів в культурі in vitro і Сегмент мікропагона гісопу з латеральною їх культивування проводять при зниженій інтенсибрунькою поміщають на живильне середовище вності освітлення. для культивування вегетативних бруньок. ІнтенсиІстотні ознаки заявленого способу мають привність освітлення становить 2,5-3 клк, температура чинно-наслідковий зв'язок з досягнутим результа23±1°С, фотоперіод 16 годин. Через 5 діб спостетом. У випадку використання висічок листка з мікрігають утворення мікропагонів. Нормально сфорропагонів гісопу після перших трьох мовані мікропагони без морфологічних змін через субкультивувань на листкових експлантах форму2 тижні культивування досягають довжини 3-4 см. вався калюс або поодинокі адвентивні бруньки, які Їх мікроживцюють на сегменти з латеральною брудалі не утворювали мікропагонів. У випадку виконькою і знову поміщають на вихідне середовище ристання висічок листка з мікропагонів гісопу після № 1. (табл. 1). Мікроживцювання здійснюють че4-5 пасажів в культурі in vitro інтенсивність утворез 2-3 тижні культивування. Спочатку коефіцієнт рення адвентивних бруньок і регенерація мікропарозмноження не перевищує 1:2, але після 4-5-го гонів досягала 90%. У випадку використання висіпасажів досягає значення 1:4. З листків мікропагочок листка з мікропагонів гісопу після 6-8 пасажів нів після 4-5-го субкультивування вирізають диски, спостерігали масову регенерацію мікропагонів, які поміщають на живильне середовище № 2 проте основна їх частина була витрифікована (табл. 1), що містить половинну концентрацію мак(обезводнена) і непридатна для подальшого розмроелементів, повний набір мікроелементів і вітаміноження. нів за рецептом МС, доповнене цитокініном тидіаЧастота пагоноутворення збільшувалася при зуроном в концентрації 4,0-7,0 мкМ (табл. 2). З зниженні інтенсивності освітлення до 1-1,5 клк і даних таблиці випливає, що максимальна кількість досягала 90%. Збільшення інтенсивності освітленадвентивних бруньок і мікропагонів утворюється ня до 2-3 клк (стандартні параметри для більшості на листкових експлантах після 8 тижнів при оптирослинних об'єктів) знижувало частоту регенерації мальної концентрації тидіазурону. Через 8 тижнів мікропагонів до 50-60%. культивування листкових експлантів відбувається Як речовину цитокінінового типу дії, що індукує активне формування адвентивних бруньок (16утворення і розвиток меристем, а також регенера20 шт./експлант). При концентрації тидіазурону цію мікропагонів у живильному середовищі вико9,0 мкМ листкові експланти утворюють калюс. ристовували тидіазурон (TDZ) - C9H8N4ОS. Вплив кількості пасажів мікропагонів на регеЗапропонований спосіб здійснюється таким нераційну здатність листкових дисків підтверджучином: готують живильні середовища згідно з ісється даними таблиці 3. З даних таблиці випливає, нуючою методикою. Склади живильних середовищ що листкові експланти, взяті з мікропагонів гісопу представлені в таблиці 1. після 3-х субкультивувань в умовах in vitro утвоТаблиця 1 рюють калюс; адвентивні бруньки і мікропагони відсутні. Максимальна кількість адвентивних бруСклад живильних середовищ для розмноження рослин гісопу ньок і пагонів утворюється на листкових експлантах, відібраних з мікропагонів гісопу після 4-5 субЖивильне середовище на різних етапах розмноження культивувань в умовах in vitro. Після 6-8 пасажів 1 2 3 на листкових експлантах утворюється маса обезКомпоненти культура культура укоріненводнених і в подальшому нежиттєздатних мікропавегетативлисткових ня in vitro гонів гісопу. них бруньок дисків Мікроелементи, мг/л: 825,0 950,0 220,0 185,0 85,0 37,3 27,8 Мікроелементи, мг/л: Н3ВО3 6,2 МnSO4•4Н2О 22,3 ZnSO4•7H2O 8,6 KJ 0,83 Nа2МоO4•2Н2О 0,25 CuSO4•5Н2О 0,025 СоСl2•6Н2O 0,025 Органічні речовини: Гліцин, мг/л 2,0 Мезоїнозит, мг/л 50,0 Нікотинова кислота, мг/л 0,5 Піридоксин-НСl, мг/л 0,5 Тиамін-НСl, мг/л 0,1 NH4NО3 KNО3 СаСl2•2Н2O MgSO4•7Н2O КН2РO4 Na2EDTA FeSO4•7H2O 825,0 950,0 220,0 185,0 85,0 37,3 27,8 412,5 475,0 110,0 92,5 42,5 37,3 27,8 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 3,1 11,15 4,3 0,415 0,125 0,0125 0,0125 2,0 50,0 0,5 0,5 0,1 2,0 25,0 0,5 0,5 0,1 Таблиця 2 Вплив концентрації тидіазурону на частоту регенерації мікропагонів гісопу з листкових експлантів в умовах in vitro Концентрація тидіазурону, мкМ 0,5 1,0 3,0 6,0 9,0 Кількість листкових експлантів з мікропагонами, %(*) форма 80882 форма 38285 4 тижні 8 тижнів 4 тижні 8 тижнів 1,2±0,1 8,0±1,4 1,5±0,1 9,0±1,2 1,5±0,1 8,0+1,4 2,0±0,2 10,0±3,5 10,0±2,0 20,0±2,5 20,0±3,0 40,0±7,9 25,0±3,0 55,0±3,0 45,0±5,0 90,0±4,0 5,0±0,5 9,0±1,6 10,0±2,0 20,0±2,5 (*) форма 80882 - гісоп з синім забарвленням віночка квітки; форма 38285 - гісоп з рожевим забарвленням віночка квітки 5 68595 Таблиця 3 Вплив кількості субкультивувань мікропагонівна регенераційну здатність листкових експлантів гісопу в умовах in vitro № пасажу 1-3 4-5 6-8 Регенераційна здатність листкових дисків морфогенетичні процеси коефіцієнт розмноження Утворення калюсу 0 Адвентивне пагоноутворення 1:16-1:20 Утворення обезводнених мікропагонів 1:10 Зменшення інтенсивності освітлення до 11,5 клк стимулює утворення мікропагонів гісопу в умовах in vitro. Це підтверджується даними таблиці 4. Таблиця 4 Вплив інтенсивності освітлення на частоту регенерації мікро пагонів гісопу з листкових експлантів в умовах in vitro Інтенсивність освітлення, клк 0 1 1,5 2 2,5 3 Кількість листкових експлантів з мікропагонами, %(*) форма 80882 форма 38285 0,0 0,0 80,0±5,0 35,0±11,0 90,0± 4,0 50,0±4,3 75,0±5,0 40,0±7,9 55,0±3,0 27,0±3,0 35,0±5,0 16,0±6,1 (*) форма 80882 - гісоп з синім забарвленням віночка квітки; форма 38285 - гісоп з рожевим забарвленням віночка квітки Комп’ютерна верстка Н. Лисенко 6 З даних таблиці випливає, що при відсутності освітлення не відбувається утворення адвентивних бруньок і пагонів. Оптимальний рівень інтенсивності освітлення для ініціації пагоноутворення і проліферації мікропагонів гісопу склав 1,5 клк. Частота регенерації і кількість мікропагонів на листковий диск значно зменшилася при інтенсивності освітлення 2 клк, а при інтенсивності освітлення 3 клк тільки низький відсоток листкових дисків був здатний до регенерації і найчастіше експланти гинуть. Слід визначити, що адаксиальне розміщення листкових дисків гісопу до живильного середовища збільшує частоту регенерації мікропагонів гісопу до 90%. На протязі року з листкових дисків від однієї рослини гісопу можна одержати близько 10000 мікропагонів, які відокремлюють і далі укорінюють. Укорінення мікропагонів проводять на живильному середовищі № 3 (табл. 1), що містить 8,011,0 мкМ ІМК. Культуральні посудини виставляють на стелажі. Інтенсивність освітлення становить 2 клк, температура 21±1°С, фотоперіод 14 годин. Через 2-2,5 тижні спостерігається утворення максимального числа корінчиків довжиною 5-6 см. Число укорінених пагонів гісопу в умовах in vitro складає 63-72% (залежно від форми гісопу). Одержані рослини готові до висадки в субстрат і адаптації in vivo. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601