Розчин для витягання ембріонів

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а частности к ветеринарии,трансплантации эмбрионов Целью изобретения является повышение технологичности npw готовления раствора, возможность осуществления стерилизации любым способом, увеличение сроков хранения. Раствор для извлечения эмбрионов содержит в 1 л бидистиллированной воды хлористый натрий, натрий фосфорнокислый двузамещенный, кзлий кислый фосфорнокислый одноэамещенный. Ингредиеьты в растворе находятся в следующем соотношении, г: хлористый натрий 8,2 - 8,7, натрий фосфорнокислый двузамещенный 2,17 - 2,8, калий кислый фосфорнокислый однозамещенный 0,2 0,4 4 табл. 120 70 DL-Лейцин L-Лизин-НСІ DL-Метионин DL Фенилаланин L-Пролин DL-Сеоин 30 50 40 50 60 20 Ои-трЄС'ЧИН DL-Триитофан < l-Тирозин DL-Валин Витамины, мг/л. Аскорбиновая кислота -Биотин Кальциферол Са-Пантотенат Холинхлорид Н^ацик Ниацинамид n-Аминобензойная кислота А Пиридоксаль-HCt Фолиевзя кислота і-Инозитол Лмиздион 40 50 1 0,05 0,01 0.10 0,01 0.50 0,025 0,025 0,05 0,025 0.01 0,05 0,01 со ел ho ю 1713529 Рибофлавин ' 0,01 тальную сыворотку, в этом нет ни биологи- ; ческой, ни экологической необходимости. Тиамин HCI 0,01 Витамин А (ацетат) 0,14 Рабочей гипотезой для поиска более Поскольку эти растворы предназначены простого солевого раствора для изготовлев большей степени для культивирования 5 ния эмбрионов, сохраняющего биологичемикроорганизмов, вирусов, культуры ткаские качества эмбрионов и обладающего ней и при контакте с внешней средой терятеми же физико-химическими параметрами, ют свое первоначальное биологическое являлось следующее положение: эмбрион качество, в связи с этим применение их для до определенной стадии обладает потенциизвлечения эмбрионов из организма самок 10 альной возможностью развития (без внесене получило широкого распространения а ния а раствор для извлечения практике, кроме того, они очень дорогостодополнительных компонентов) и он это яющие. свойство сохраняет в промывочной среде. Используемые солевые растворы для Наиболее широкое распространение для извлечения эмбрионов получил раствор 15 извлечения эмбрионов, а том числе и предДюлбекко следующего состава: лагаемый рэстоор Дюлбекко, обогащаются из матки органическими и минеральными, $ Натрий хлористый 8.0 также биологически активными веществаКалий хлористый * 0,200 ми, которые сохраняют биологические кэчеНатрий фосфат двузамещенный безводный 1,15 20 ства эмбрионов и обеспечивают Калий фосфат однодальнейшее их развитие. Так же не обязазэмещенный 0,20 тельно и делать солевой раствор сильно щелочной (более 7,0 - 7,1) для извлечения Магний хлористый 6-водэмбрионов, поскольку в самой маточнои поный 0,10 25 лости среда щелочная. Кальций хлористый безводный _ 0,10 Цепью изобретения является повышеНатрий пируаиат ' . 0,036 ние технологичности приготовления раствоГлюкоза 1.0 ра, снижение стоимости, возможность Вода бидистиллироосуществления стерилизации любым извеваннэп До 1000,0 30 стиым способом и увеличение сроков хранеНепосредственно перед применением ния раствора, в раствор дополнительно вносят 20 мл феВ известном растворе, в состав которотальной сыворотки и антибиотики (пеницилго входит на 1 л бидистиллиооеанной воды яинкалиевая соль 0,03 мг/мл и NaCS, ЫагНРСХ KH2PQ4. все указанные ингстрептомицин 0,05 мг/мл). Концентрация 35 редиенты берут в следующем соотношении: водородных ионов (рН) раствора колеблется 7,05 - 7,4 и осмотическое давление 290 - 300 NaCI • 8.2-8.7 мосмоль. Na2HPO4 2,17-2,8 Компоненты растворяют в указанной КН2РО4 0,2-0,4 последовательности и стерилизуют путем 40 Для получения раствора приготовлены фильтрации под давлением через бактерисмеси ингредиентов, содержащие каждая в альные фильтры типа Зейцэ или Милипоро1 л бидистиллированной воды различные вые фильтры. соотношения (граничные и заграничные}. Данные сведены в табл.1. Каждая смесь гоПри изготовлении раствора Дюлбекко образуются труднорастворимые осадки уг- 45 товится отдельно и подвергается измерелекислых и фосфорнокислых солей кальция нию физико-химических параметров и и магния. Б связи с этим соли кальция и выживаемости эмбрионов при инкубации в магния растворяют отдельно и в виде расэтих растворах. Эффективность растворов твора добавляют к основной части его, оценивают по способности эмбрионов кульвключающей остальные компоненты. Необтивироваться In vitro в предлагаемом расходимость поэтапного изготовления рас- 50 творе в течение 24 ч, в качестве контроля твора и его м н о г о к о м п о н е н т н о е ^ , использован раствор Дюлбекко, Поскольку изменение качества при стерилизации, авважным условием выживания является токлаверовании ионизирующими лучами, быконцентрация водородных ионов (рН) и осстрое размножение микроорганизмов при момолярность, то в предлагаемом растворе контакте с внешней средой, при котором он 55 эти показатели имеют оптимальные величиприобретает токсичность, все это усложняны, необходимые для развития эмбрионов, ет его применение и повышает стоимость. а именно: 292 ж 3,7 мосмоль и рН 7,1. Не обоснованно вносят в раствор для Преимуществом предлагаемого раствополучения эмбрионов антибиотики w фера по сравнению с известным является 1713529 увеличение сроков хранения раствора, возможность его стерилизации и приготовления, снижение затрат на его изготовление и снижение стоимости раствора более чем в 10 раз. Для подтверждения того, что предлагаемый раствор не уступает известному, поставлены опыты по выживаемости эмбрионов (табл 2). В табл.3 приведены физические показатели растворов после использования. Из табл 2 видно, что при культивировании In vitro эмбрионов, полученных опытным раствором и известным раствором, разницы в их развитии и выживаемости не наблюдалось А это касается концентрации водородных ионов (рН) и осмотического давления (табл 3), отклонения этих показателей от нормы в известном растворе больше, чем в предлагаемом Удельная плотность известного и предлагаемого растворов одинаковы до и после использования этих растворов для извлечения эмбрионов. Учитывая, что эмбрионы находятся в течение малого времени в промывочной жидкости при извлечении их из матки, а также тот факт, что в этот период жизни не велики физиологические потребности эмбриона в питательных веществах, а эти необходимые питательные вещества эмбрион для поддержания физиологической функции получает из промывочной жидкости матки, поскольку промывочная жидкость из матки обогащается пролефератом железистого эпителия эндометрия, содержащим полный комплекс биоорганических веществ в достаточном количестве, нет необходимости вносить в раствор дополнительно питательные вещества. 3 связи с этим главным является поддержание физико-химических параметров раствора, а именно этого добиваются, используя предлагаемый раствор. Предлагаемый раствор позволяет использовать любой способ стерилизации, что невозможно осуществить в известном способе. Для под 5 10 15 20 25 6 тверждения преимущества предлагаемого раствора проведены опытные испытания растворов для изучения физико-химических свойств их после стерилизации ускоренными электронами и эвтоклавировзнием, Данные сведены в табл.4. Из табл.4 видно, что при стерилизации известного раствора ускоренными электронами так же как и при кипячении наблюдается изменение цвета раствора, он приобретает желтую окраску. При этом входящие в состав известного раствора прототипа и глютэминовая кислота деполимеризуются и при этом изменяется и качественный состав. При этом концентрация водородных ионов известного раствора сдвигается в щелочную сторону, что отрицательно сказывается на выживаемости эмбрионов. Данные, вытекающие из табл.4, убеждают в том, что известный раствор, при воздействии на него факторов внешней среды, менее устойчив как по качественному составу, так и по физико-химическим параметрам, чем предлагаемый раствор. Формула изобретения Раствор для извлечения эмбрионов, со30 держащий бидистиллированную воду, хлористый натрий, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий кислый фосфорнокислый однозамещенный, отличающ и й с я тем, что. с целью повышения 35 технологичности приготовления раствора, возможности осуществления стерилизации любым способом, увеличения сроков хранения, он содержит ингредиенты в следующем соотношении, г/л бидистиллированной во40 ды: Хлористый натрий 8,2 - 8,7 Натрий фосфорнокислый двуэамещенный 2,17-2,8 Калий кислый фосфор45 нокислый однозамещенный 0,2 - 0,4 Таблица 1 Опыт Предлагаемый 1 Количество веществ на 1 л раствора, г Физико-химические показатели Калий Бидистил- Осмотиче- КонцентНатрий Натрий хлористый фосфорно- фосфорно- лирован- ское дав- рация вокислый кислый ная вода дородных ление, однозаме- однозамеионов м осмол ь щенный щенный (РН), отн.ед. 8,0 2,0 0.1L юоо.о 278±4,5 6,8 Выживаемость эмбрионов при инкубировании In vitro в течение 24 40 8 1713529 Продолжение тзбл.1 Количество веществ на 1 л раствора, г Физико-химические показатели Калий Натрий Натрий Бидистил- Осмотиче- Концентхлористый фосфорно- фосфорно- лирован- ское дав- рация вокислый кислый нэя вода ление, дородных одкозаме- одноззмемосмоль ионов щенный щенный (РН). отн ед. Опыт 2 3 4 5 Контроль (п-5) ?,17 2,5 2,8 3,0 Раствор Дюльбекко 8,2 8,5 3,7 9,0 0,2 0,4 0,45 1000,0 1000,0 1000,0 0,5 1000.0 284±4,0 292 ±3,7 298±3,8 310±5 03 294 ±0,2 6.9 7,16 7,28 7.4 7,3 Выживаемость эмбрионов при инкубировании !п vitio в течение 24 ч, % 53 80 62 48 78 Таблица 2 Раствор Дюльбекко Предлагаемый Раствор Количество куль- Количество жиз- Процент выжитивированных ваемости неспособных эмбрионов эмбрионов 18 94,7 19 , 95,0 20 19 Таблица 3 Концентрация водородных ионов fpH) до исполь- после использования зования Плотность среды до использования Осмомолярнс^ть, мое- ' моль после ис- до исполь- г осле использовазования пользования ния Левый рог Дюльбєкко(п = 7) Предлагаемый {n = 8) Правый рог 7 2 ±0,05 7.45±0,06 7,44 ±0,04 1,05 1,05 300 ±8 2 310±8,5 7 1 ±0,55 7,16+0,03 7,2 ±0,08 1,05 1,05 294 ±4 А 296 :t4 5 Таб л и ц а А Раствор Цвет до стериліпации Предлагае м ы й (п *• Q) Дюльбекко(п *7) Бесцяет ный То же после стерилизации Ускорен Кипячениными элекем тронами БесцветБесцветный ный Желтый Желтый Бэктериопогическое исследование до стери- после стелиззции рилизации Рост мик- Отсутствие робов (+) роста микробов (-) Рост мик- Отсутствие робов f+) микробов Концентрация водородных ионов D H до стери- после стелизации рилиаации 71 7,1 12 7,3 ("Ї Редактор Н, Бобкова Составитель Е Кузнецова Техред М Моргентал Корректор О. Кундрик Заказ 641 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул Гагарина, 101