Спосіб здобуття ізольованих гепатоцитів

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии к экспериментальной медицине. )\елъ изобретения - повышение выхода жизнеспособных гепато цитов. Способ включает однократную перфузию печени раствором, содержа- I щим ЭДТА, с последующей дезагрегацией ткани в сахарозной среде с помощью вибрации. Перфузию органа проводят в сахарозной среде, содержащей Э Т в концентрации 3,5-4,5 мМ, ДА при этом компоненты перфузионной среды берут в следующем соотношении, г/л: сахароза 70-100; хлористый калий 0,3-0,4; хлористый магний 0 , 1 0,2; фосфорнокислый калий 0,03-0,08; фосфорнокислый натрий 0 , 0 5 - 0 , 1 ; Э Т ДА 1,3-1,675, трис-HCl буфер (50 мМ) до 1 л . Выход от 520+40 до 6ООІ6О клеток на вес печени. 3 табл. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине. Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных гепатоцитов. Способ включает перфузию печени раствором, содержащим ЭДТА, с последующей дезагрегацией ткани в сахарозной среде с помощью вибрации, причем перфузию органа проводят в сахарозной среде, содержащей ЭДТА в концентрации 3,5-4,5 мМ, при этом компоненты среды берут в следующем соотношении , г /л: Сахароза /0,0-100,0 Хлористый калий 0,100-0,А')0 Хлористый магний 0,100-і),2,Ю Фосфор нокислыи калий Фосфор нокислыи натрий ЭДТА Трис-HCl буфер (50 мМ) 0,030-0,080 0,050-0,100 1,300-1,675 До 1 л П р и м е р 1. Перфузию печени животных весом 200-300 г проводят in v i v o . Для этого вскрывают брюшную полость анестезироваиных животных, вводят инъекционную иглу в в о ротную вену и закрепляют лигатурой, а нижнюю полую вену надсекают в месте ответвления правой почечной вены для оттока перЛузата. Перфузию проводят через систему переливания крови с использованием перистальтического иасо* са 0,15 М сахарозным раствором, с о держащим 4 м ЭДТА при следующем соотМ т 1-655109 їуфера, рН / , 4 : Сахароза Хлористый калии Фосфорнокислый калий 85,50 0,372 ,. 0,054 4 П р и м е р 3. Способ осуществля~і ют аналогично примеру 1, но перфузию проводят растворами, одни из которых) содержат минимально допустимые, а другие - максимально допустимые количества компонентов, г/л: Фосфорнокислый натрий 0,071 Хлористый магний 0,162 10 ЭДТА 1,400 Трис-HCl буфер (50 мМ) " До 1 л Д Нагретый до 40 С и аэрированный раствор пропускают через орган со ско~5 ростью 25 мл/мин в течение 15-20 мин (объем перфузата 500 м л ) . По окончания перфузии печень и з влекают из брюшной полости, измельчают ножницами и подвергают д е з а г р е г а - ?о ции с помощью вибрационного устройств а . Полученную суспензию фильтруют ч е р е з нейлоновый фильтр. Отделение жизнеспособных гепатоцитов or поврежденных проводят путем центрифугирова-25 ния первичной суспензии гепатоцитов в течение 5 мин при 1000 об/мин. Жизнеспособные гепатоциты располагаются в нижнем темном слое осадка, разрушенные КЛеТКИ СОСТаВЛЯЮТ верХНИН СВеТЛЬЙ J0 I II 70, 0 100,0 Сахароза 30 0 Хлористый калий 0,400 Хлористый магний , 100 0,200 Фосфорнокислый 0,030 0,080 калий Фосфорнокислый 0,050 натрий 0,100 1,225 ЭДТА 1,575 Трис-HCl буфер (50 мМ) До 1 л Результаты приведены в т а б л . 3 . Анализ данных т а б л . 3 с в и д е т е л ь ствует о том, что перфузия печени растворами, содержащими минимальные и максимальные количества компонент о в , обеспечивают возможность получения большого количества клеток с высокой морфо-функциональной а к т и в ностью. с л о й . После отделения и промывки жизнеспособных клеток нижнего слоя их переводят в среду хранения и подвергают морфо-функциональному анализу. Клетки характеризуются четким контуром плазматической мембраны, плотным 35 внутриклеточным матриксом желто-зеленоватого ц в е т а , характерным для живых клеток. В т а б л . 1 представлены морфо-функциональные характеристики гепатоцитов, „выделенных предлагаемым и известными способами. П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но варьируют 45 концентрацию ЭДТА в перфузионной среде. Результаты представлены в табл. I Из табл. 2 видно, что оптимальная концентрация ЭДГА 3,5-4,5 мм, при жении концентрации ЗДТА в перфузионном растворе резко снижается количество получаемых клеток. Способ получения изолированных гепатоцитов, включающий перфузию п е ч е ни солевым раствором, содержащим ЭДТА, дезагрегацию полученной ткани в сахарозной среде с-помощью вибрации и выделение целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, ч т о , с ц е лью повышения выхода жизнеспособных гепатоцитов, перфузию осуществляют однократно, а в качестве солевого раствора, содержащего ЭДТА, используют сахарозную среду при следующем количественном соотношении компонентов, г/л: 70,0-100,0 Сахароза 0,300-0,400 Хлористый калий 0,100-0,200 Хлористый магний Фосфорнокислый 0,030-0,080 калий Фосфорнокислый 0,050-0,100 натрий 1,300-1,675 ЭДТА До 1 л Трис-HCl буфер Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я 1655ГЇ9 Способ Показатель I предлагаемый Вес животного, г 200-300 Количество клеток на вес печени„ млн.кл. 553±60 Количество клеток на г печени, млн.кл. /3+8 Исключение трипанового синего, % 90+5 Уровень внеклеточной активности ЛДГ, % 10+3 Скорость эндогенного дыхания, н 0^/мин млн. кл. М 1/,3+0,3 Коэффициент стимуляции эндогенного дыхания сукцинатом 1»?5 Содержание АТФ, нМ/млн. клеток 25+5 известный РОО-300 26,3+4 91+2 15±2 17»1±->»2 U 33 22 Т а б л и ц а 2 Концентрация ЭДТА, мМ Показатель 3,5 Количество клеток на вес печени Mil И . КЛ . Исключение трипанового синего, % Уровень внеклеточной активности ЛДТ, % Скорость эндогенного дыхания, н О^/мин млн. кл. М Содержание АТФ, нМ/млн.кл. 52O±4O 9413 600±60 91** 10±2 12±3 17,3+0,3 25+5 • 17,1+0, 30+5 Т а б л и ц а З Показатель Соотношение компонентов минимальное Количество клеток на вес печени 520+40 Исключение трипанового синего, % 90+2 Уровень внеклеточной активности ЛДТ, X 11±2,0 Скорость эндогенного дыхания, н 02/мин М млн.кл. 16,8+2,1 Содержание АТФ, нМ/млн.кл. . 20,1+3,0 Редактор Л.Волкова | максимальное 600+60 91+3 12+2,4 17,'Н?,3 18,4+2,1 Составитель А.Маныкин Техред Л.Олийньос- Корректор С.Шекмар Заказ 2196/ДСП Тираж 221 Подписное Р И П Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ПСНТ СССР ЧИИ 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д . 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101