Спосіб приготування основи для живильних середовищ для вирощування мікроорганізмів

Изобретение относится к общей и медицинской микробиологии, а именно получению питательной среды для выращивания микроорганизмов. Оно может быть использовано в научно-исследовательской и практической работе как для выделения и культивирования микроорганизмов, так и для накопления их биомассы в крупнотоннажных промышленных масштабах. Выделение микроорганизмов из объектов среды, получение их биомассы осуществляют на питательных средах. В зависимости от происхождения среды подразделяют на сложные непостоянного состава мясопептонный бульон (МПБ), картофельная среда и др. и синтетические среды постоянного состава, питательные компоненты которых вводятся в определенную среду строго по прописи (Мейнел Дж., Мейнел Э., 1967). Сложные среды непостоянного состава более полно, по сравнению с искусственными, удовлетворяют трофическим потребностям растущих микроорганизмов, так как они содержат практически все необходимые для клеток вещества (белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, минеральные компоненты и т.п.), находящиеся в легкодоступной форме. Именно на таких средах растут условно-патогенные и патогенные микроорганизмы, обусловливающие инфекционно-воспалительные процессы различной локализации у человека и животных, К таким средам прежде всего относится мясопептонный бульон, который готовится прибавлением к мясной воде 1% пептона и 0,5% хлористого натрия с последующим кипячением 20 минут при помешивании, pH среды устанавливают добавлением щелочи (10% раствор едкого натра) до 7,6 - 7,8. Для стабилизации pH, рекомендуют добавлять к бульону фосфатные буферные смеси с последующим кипячением среды 35 - 45 минут до выделения осадка. Затем среду фильтруют, добавляют водой до первоначального объема и стерилизуют в автоклаве при 120°C (1атм) в течение 15 - 20 минут. На основе МПБ готовится ряд сред специального назначения. Мясная вода готовится из дорогостоящего дефицитного пищевого сырья - обезжиренной высокосортной телятины или говядины (Пяткин К.Д. и соавт. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. - М.: Медицина, 1969. - С.62). Стоимость 1л МПБ 9тыс.крб. В силу этого среды, приготовленные на основе МПБ, как правило дефицитны даже для лабораторных исследований. Практически не реально применять эти среды для получения микробной биомассы в крупнотоннажном процессе. Помимо МПБ в медицинской микробиологии используют питательные среды, основой которых является триптический перевар или насой бычьих сердец (Скрипаль И.Г., Малиновская Л.П., 1984). Обогащенные добавками (лошадиной сывороткой и дрожжевым экстрактом) эти среды используют для выделения микоплазм, уреаплазм, Л-форм бактерий - микроорганизмов, вызывающих заболевания человека и животных, и не растущих на каких-либо других питательных средах. Стоимость одного литра этой среды более 24тыс.крб., что указывает о ее дороговизне. Описаны способы приготовления питательной среды из свежей плаценты (Отраслевое рационализаторское предложение №423 от 11 мая 1986г. "Питательная среда для выделения и культивирования урогенитальных уреаплазм"). Несмотря на высокую чувствительность питательной среды, вряд ли она может найти широкое внедрение, т.к. плацента - ценное сырье для косметической промышленности. Известны способы получения питательных сред, близких по качеству к МПБ, но получаемых из дешевых субстратов. Так, для производства биомассы сапрофитного микроорганизма Bas. subtilis получают питательную среду на основе сусла, а также среду, содержащую минеральную основу и органические источники питания, из гидролизата вермикулитовой подстилки, применяемой на птицефабриках (А.с. №1124029). Однако в настоящее время птицефабрики отказались от применения вермикулитовых подстилок, применяя более прогрессивный способ содержания птиц в клетках, исключающий использование каких-либо подстилок, а среда на основе сусла бедна на питательные элементы для многих групп микроорганизмов. Наиболее близким по технической сущности является питательная среда на основе помета птиц, которая подвергается анаэробной бактериальной ферментации с доведением количества аммиака в ней как источника азота до 0,4 - 2,2%. Приготовленная таким образом питательная среда использовалась для культивирования дрожжей (Дик Питер Хенри, Патент Австралии №475824, кл. C07 67/00, A23 1/18, A23K1/00, 1976). В известном решении среда избрана авторами в качестве прототипа как наиболее близкая по сущности к заявляемому объекту. Недостатком этой питательной среды является то, что в среде на основе помета птиц в достаточном количестве присутствуют только жирные кислоты (уксусная, пропионовая, масляная, валериановая) и в недостаточном количестве для выделения и культивирования многих групп микроорганизмов присутствуют белки, аминокислоты, витамины, Это существенно снижает возможности использования данной среды для выделения и культивирования разных групп микроорганизмов. Задача, которую решает изобретение, состоит в создании оптимально сбалансированной питательной среды для выделения и выращивания микроорганизмов различного таксономического положения и получения в промышленных масштабах биомассы микробных культур, при значительном снижении ее себестоимости. Поставленная цель достигается тем, что в качестве исходного питательного сырья используют помет домашней птицы после следующей обработки: помет соединяют с водой при содержании 50 - 100г его в 1л воды. Полученную массу подвергают аэробному брожению при 28 - 40° в течение 48 часов, а затем подвергают анаэробному сбраживанию при 60°C в метантенке. Время анаэробного сбраживания 3 - 5 суток. Твердую часть среды отделяют центрифугированием, жидкую фракцию разливали в стеклянную посуду и стерилизуют 30мин при 0,5атм. Разлитая и простерилизованная жидкая фракция являлась питательной средой для выделения и культивирования микроорганизмов различных таксономических групп, в том числе микоплазм, уреплазм, Л-форм бактерий. С целью получения твердой питательной среды к жидкой фракции добавляют агар, причем концентрации этого желирующего реагента могут быть ниже применяемых для изготовления МПА. Например, если для создания твердой среды на основе МПБ необходимо добавить 2г/л агар-агара, то аналогичное по плотности желирование на основе предлагаемой питательной основы осуществляется при добавлении на 1л 1,3 - 1,5г/л агара. Химический состав предложенной универсальной питательной среды приведен в табл.1. Для сравнения приводим состав компонентов среды на основе среды, полученной при анаэробном сбраживании помета (среда по прототипу), и предлагаемой универсальной питательной среды. Анализ данных табл.1 свидетельствует о том, что разработанная универсальная питательная среда является обогащенной, ценными питательными элементами (витаминами, аминокислотами, и другими) для микроорганизмов. Пример. 1. Для получения среды с концентрацией компонентов, лимитирующих рост микробных культур в колбу с 1л водопроводной воды, вносили 50г исходного помета с влажностью 70%. Содержимое колбы тщательно перемешивали и подвергали анаэробному сбраживанию при 30°C в течение 48 часов на качалках (160об./мин). Затем содержимое колбы продували 5 минут инертным газом (аргоном) и в колбу вносили термофильную анаэробную метаногенную ассоциацию (100мл инокумма на 1л среды), после чего проводили анаэробное сбраживание помета при 60°C в термостате. Время анаэробного сбраживания составляло 3 суток. Затем твердую часть отделяли центрифугированием, жидкую фракцию разливали в посуду и стерилизовали 30 минут при 0,5атм. На полученной таким образом питательной среде культивировали различные виды микроорганизмов. Накопление их биомассы на этой среде представлено в табл.2. Пример 2. Для получения среды с концентрацией компонентов среды, обеспечивающих оптимальный рост микробных культур, в колбу с 1л водопроводной воды вносили 75г исходного помета с влажностью 70%. Последующие операции по получению питательной среды проводили аналогично, как приведено в примере 1. Накопление биомассы различных микробных культур на приготовленной среде представлены в табл.2. Пример 3. Для получения среды с максимально допустимой концентрацией компонентов среды в колбу с 1л водопроводной воды вносили 100г исходного помета с влажностью 70%. Последующие операции по получению питательной среды проводили аналогично, как приведено в примере 1. Накопление биомассы различных микробных культур на приготовленной среде представлены в табл.2. Пример 4. Для получения среды с ингибирующими концентрациями компонентов среды в колбу с 1л водопроводной воды вносили 100г исходного помета с влажностью 70%. Последующие операции по получению питательной среды проводили аналогично, как приведено в примере 1. Накопление биомассы различных микробных культур на приготовленной среде представлены в табл.2. Следовательно, как видно из табл.2, можно заключить, что минимально допустимая концентрация помета для приготовления среды 50г/л воды. Значения менее 50г/л воды будут лимитирующими. Оптимальная концентрация помета для приготовления питательной среды 75г/лводы. Максимально допустимая 100г/л воды. Как ранее было показано, разработанная основа питательной среды является обогащенной ценными питательными элементами для микроорганизмов (табл.1). В подтверждение вышесказанного приводим данные по накоплению биомассы различных микроорганизмов на основе из помета по предлагаемому прототипу и заявляемой питательной среде (табл.3, 4). Практически все изученные культуры в течение 48 часов роста накапливали до одного и более грамма клеточной биомассы. Наращивание биомассы проводили в 0,5л колбах на качалках 160об./мин при температуре 28 - 30°C, а также в условиях непрерывного культивирования в ферментерах типа АНКУМ-2 и АК-10. Как видно из данных, представленных в табл.2 и 3, на разработанной питательной среде отмечен наиболее активный рост как условно-патогенных микроорганизмов, так и сапрофитных, получаемых в промышленном масштабе. Достигнутый эффект объясняется наличием в предлагаемой питательной среде значительного количества витаминов, микроэлементов, аминокислот и других ростовых факторов. Все выросшие на предлагаемой среде культуры микроорганизмов были морфологически идентичны исходным культурам и не имели каких-либо различий при идентификации по биохимическим свойствам. На полученной среде можно выделять также микроорганизмы, не имеющие стабильной клеточной стенки микоплазмы, уреаплазмы, что позволит применять ее для диагностики воспалительных заболеваний, микробного происхождения у человека и животных. При выделении микоплазм для подавления сопутствующей микрофлоры использовали ацетат калия, пенициллин, а в качестве индикатора фенолрот. Таким образом, полученную нами из отходов птицефабрик (помет домашней птицы) жидкую фракцию, которая после комбинированной обработки путем аэробного и анаэробного сбраживания, можно использовать как органоминеральную питательную среду для выращивания микроорганизмов различных таксономических групп. Использование этого сырья для получения питательной среды-с целью организации крупнотоннажного наращивания практически ценных микробных культур позволит организовать безотходное производство птиц и животных, значительно улучшить экологическую обстановку на животноводческих комплексах и осуществить экономию ценного и дорогостоящего пищевого сырья - мяса крупного рогатого скота.