Штам бульбочкових бактерій mesorhizobium ciceri h-12, активний симбіотичний азотфіксатор, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує врожайність нуту

Штам бульбочкових бактерій Mesorhizobium ciceri Н-12, активний симбіотичний азотфіксатор, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує врожайність нуту, депонований у колекції Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН за № 56. (19) (21) u200602716 (22) 13.03.2006 (24) 16.10.2006 (46) 16.10.2006, Бюл. № 10, 2006 р. (72) Толкачов Микола Захарович, Дідович Светлана Віталіївна, Каменєва Ірина Олексіївна (73) ПІВДЕННИЙ ФІЛІАЛ ІНСТИТУТУ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ МІКРОБІОЛОГІЇ УКРАЇНСЬКОЇ 3 17664 ні, висока вимогливість до умов культивування і збереження, що ускладнює технологію стабільного одержання високоякісного інокулюму. В основу корисної моделі поставлена задача одержання штаму бульбочкових бактерій, спроможного більш ефективно зв’язувати азот атмосфери в симбіозі з рослинами нуту, більш технологічного для виробництва бактеріальних препаратів, що підвищують урожай зерна нуту. Поставлена задача вирішена шляхом виділення у 1987 році з бульбочок нуту сорту Совхозний 14 на насіннєвих посівах Селекційногенетичного інституту УААН - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення нового високоефективного штаму бульбочкових бактерій Н-12, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує урожайність нуту. Виділений шляхом аналітичної селекції штам Mesorhizobium ciceri Н-12 має такі властивості, які переважно співпадають з властивостями штамуаналогу. Бактерії в молодих культурах рухливі за рахунок джгутиків. Розмір паличок 2,0-2,2х0,50,6мкм. Штрих на агаризованому гороховому середовищі рясний, слабо-білуватий, плоский, сли 4 зуватий, стікаючий. Колонії клітин однотипні, круглі, білі, опуклі, слизуваті. Відмічена різниця у швидкості росту колоній: у штаму 527 колонії до 1,5мм у діаметрі з’являються на восьму - дев’яту добу, у штаму Н-12 - на п’яту добу. На МДА колір колоній злегка жовтуватий для обох штамів. На МПА штам 527 не росте або росте гірше, ніж штам Н-12. Штам-аналог 527 і штам Н-12 молоко з лакмусом підкислюють (через два місяці лакмус рожевіє). Оптимальна температура для росту і розмноження обох штамів 26-30 С. Штами стабільно зберігають свої властивості на гороховому агарі при температурі +4 С, термін пересіву 4-6 місяців. Штам Mesorhizobium ciceri H-12 формує ефективний симбіоз із більшістю сучасних районованих сортів нуту, що забезпечує стійкий попит споживачів на інокулюм нового штаму. В польовому досліді Кримського інституту Агропромислового виробництва на південному чорноземі з шістьма сортами нуту селекції Селекційно-генетичного інституту УААН (2003 рік) він за ефективністю азотфіксації був на рівні штаму еталону в симбіозі з п’ятьма сортами і суттєво перевищував еталон на сорті Карпово (Таблиця 1). Таблиця 1 Варіант досліду Контроль Штами: еталон H-12 НІР05 Розанна 18,7 21,0 20,7 0,6 Урожай зерна сортів нуту в ц/га Олександрит Пам’ять Діамант 19,1 18,4 19,9 21,9 22,4 0,7 Новий штам Mesorhizobium ciceri H-12 є більш технологічним. У виробничих рідких живильних середовищах він швидше накопичує кількість клітин до 20,0-35,0млрд.КУО/мл, ніж штам 527 (7,018,0млрд.). Штам H-12 відзначається кращою адаптацією у сипучих субстратах в порівнянні із штамоманалогом, що сприяє одержанню біопрепаратів із високим титром бактерій. Штам H-12 менш вимогливий до умов збереження в препаративних формах, що може збільшити термін ефективної дії біопрепарату. Зазначена вище сукупність суттєвих ознак штаму Mesorhizobium ciceri H-12 підтверджує можливість одержання очікуваного технічного результату. Характеристика штаму бульбочкових бактерій Mesorhizobium ciceri Н-12. Номенклатурні дані: рід - Mesorhizobium; вид - Mesorhizobium ciceri, депонований у колекції Інституту сільськогосподарської мікробіології під реєстраційним номером 56 у групі бульбочкових бактерій. Походження штаму. Штам Mesorhizobium ciceri H-12 було отримано у Південному філіалі Інституту сільськогосподарської мікробіології YAAH з бульбочок нуту сорту Совхозний 14, відібраних на насіннєвих посівах Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення у 1987 році. 19,6 19,9 0,6 20,9 20,7 0,6 Буджак 19,9 Карпово 20,1 20,0 19,9 0.5 21,7 22,9 0,6 Спосіб виділення. Штам виділений методом аналітичної селекції із свіжих бульбочок нуту Толкачовим М.З. Штам ідентифікований Дідович С.В. і Каменевою І.О. по визначнику Берге 1984 року, методичним рекомендаціям ІСГМ РАСГН [Возняковская Ю.М., Попова Ж.П. Методические рекомендации по идентификации неспоровых бактерий, доминирующих в ризосфере растений - Л. - 1985. 48с.] і, згідно сучасній систематиці, визначений як вид ризобій, нодулюючих нут, порівняний із типовим штамом бактерій Mesorhizobium cicer 527,депонованим у колекції ВНИИСХМ під №2107. Біотехнологічна характеристика. Штам Mesorhizobium ciceri H-12 утворює бульбочки на коренях різноманітних сортів культурного та диких видів нуту і завдяки наявності ферменту нітрогенази в симбіозі з рослинами фіксує азот атмосфери, що підвищує їх продуктивність. Нітрогеназна активність, яка визначалася методом ацетиленредукції на газовому хромотографі „ХРОМ-5”, у фазу цвітіння рослин становила 1,2-11,6мк Моль етилену на 1 рослину за годину. Культурально-морфологічні ознаки. Клітини 57-добової культури штаму Mesorhizobium ciceri H12 - рухливі палички, розміром 2,0-2,2х0,5-0,6мкм, рухливі, завдяки наявності джгутиків. Штам H-12 грамнегативний, спор не утворює, облігатний аероб. Зростання бактерій при посіві штрихом на агаризованому гороховому середовищі з сахаро 5 17664 зою рясне, слабо-білуватого кольору, плоске, слизувате, стікаюче. Колонії клітин на твердих середовищах (нутовий, бобовий, маніто-дріжджовий агар) однотипні, круглі з рівним чітким контуром, блискучі, білувато-прозорі, опухлі, слизуваті, до 1,0-1,5мм у діаметрі, з’являються на п’яту добу. Пігментація відсутня. Належить до повільноростучих бульбочкових бактерій. Фізіолого-біохімічні властивості. За джерело вуглецю штам добре використовує різноманітні його форми. Середовища з моносахаридами (глюкоза, арабиноза, ксилоза, рамноза), цукровими спиртами (сорбіт, маніт) та дисахаридами (сахароза, лактоза, мальтоза, харчовий цукор) підкислює і добре росте. Середовища з трисахаридами (рафиноза), шестиатомним спиртом (дульцит) підлужує, росте помірно. Штам Н-12 не використовує як єдине джерело вуглецю органічні кислоти, зокрема цитрат. За джерело азоту штам використовує азот мінеральних солей (амонійний, нітратний), наприклад, інтенсивно росте на середовищі Козера, а також амідний азот. На середовищах з органічними джерелами азоту (гороховому, путовому та капустяному агарі) інтенсивно росте. На МПА та Гліцерино-пептонному агарі (ГПА) відмічено помірний ріст та збереження слизу і блиску до 1 місяці, ще через місяць полісахаридний слиз висихає. Штам Н-12 виявляє нітратредуктазну активність (утворює фермент нитратредуктазу, відновлюючи нітрати до аміаку); уреазну активність (синтезує фермент уреазу); каталазну активність (синтезує фермент каталазу). Штам Н-12 не має протеолітичної активності (не розріджує желатин); амилазної активності (не гідролізує крохмаль); не виявляє оксидазної активності. Штам Н-12 добре розвивається на картопляній скибочці, викликаючи легке побуріння та утворюючи слизистий наліт білувато-жовтуватого кольору. При культивуванні штаму на обезжиреному стерильному молоці через тиждень відзначається відновлення лакмусу, а ще через тиждень спостерігається утворення прозорого кільця (4-5мм), через місяць - слабке підкислення середовища. Температурний інтервал росту штаму Н-12 на 6 твердих і в рідких середовищах складає 20-37 С, а температурний оптимум 26-30 С. Зростання бактерій спостерігається в діапазоні pH 4,5-8,5, оптимальною для розвитку клітин штаму Н-12 є близька до нейтральної реакція середовища pH 6,5-7,5. Ознаки штаму стійкі. Штам не є патогенним. Культуру зберігають на манітно-дріжджевому середовищі або на гороховому агарі з сахарозою при температурі 4-5 С. Пересівають один раз у чотири-шість місяців. Штам утворює активні бульбочки з усіма сортами нуту, що вирощують на Україні. На інших бобових культурах бульбочки не утворює. Штам бактерій Mesorhizobium ciceri Н-12 використовують для виготовлення біопрепарату під нут по технології соєвого ризобофіту (ТУ У 319. 00494456-006-2000). Зберігають препарат при температурі 8-12 С у сухому провітрюваному помешканні окремо від отрутохімікатів. Обробку насіння нуту проводять в день посіву або невеличкими партіями безпосередньо перед посівом. Передпосівну обробку насіння біопрепаратом виконують вручну або механічно в машинах для протруєння насіння. Ручну обробку насіння вермикулітним біопрепаратом Mesorhizobium ciceri Н-12 здійснюють у такий спосіб: на брезент насипають насіння нуту в кількості, що відповідає 1 чи 2 гектарним порціям, і обробляють препаратом, потім насіння перемішують, по черзі підіймаючи протилежні кінці брезенту до рівномірного розподілу препарату на поверхні насіння. Оброблене біопрепаратом насіння затарюють у мішки та вивозять у поле для посіву. Механізовану обробку насіння біопрепаратом здійснюють машинами для протруєння насіння, наприклад, ПСШ-3, ПС-10, за технологією, аналогічною технології протруєння. Перед роботою машини для протруєння необхідно ретельно очистити від хімікатів, промити і знешкодити згідно до санітарних правил. Ефективність симбіозу штамів бульбочкових бактерій з різними сортами нуту у вегетаційних дослідах на безазотному субстраті в фазу цвітіння наведена у Таблиці 2. Таблиця 2 Варіант досліду Кількість бульбочок на рослину Контроль - без інокуляції Штам 527 Штам H-12 НІР05 7 11 2 Контроль Штам 527 24 Штам H-12 НІР05 24 3 Біомаса бульбочок, *Н.А., мкМоль етилемг/рослину ну/рослину за годину Сорт Смачний, 2000р. 183 226 42 Сорт Розана, 2002р. 289 268 66 Зелена маса нуту, г/рослину 4,2 1,46 3,11 0,55 5,1 6,6 0,4 1,7 4,2 6,4 1,9 0,2 6,8 0,5 7 17664 8 Продовження таблиці 2 Варіант досліду Кількість бульбочок на рослину Контроль Штам 527 Штам H-12 HIP05 49 33 6 Контроль Штам 527 Штам H-12 Найменша істотна різниця НІР05 25 74 80 12 Біомаса бульбочок, *Н.А., мкМоль етилемг/рослину ну/рослину за годину Сорт Олександрит, 2004p. 651 0,6 475 0,4 144 0,3 **Сорт Тріумф, 2005p. 400 0,3 570 1,6 480 1,3 90 Зелена маса нуту, г/рослину 2,9 6,1 5,8 0,6 4,1 5,0 5,0 2,0 0,6 *Н.А. - нітрогеназна активність бульбочок **В досліді використано нестерильне насіння нуту сорту Тріумф. За ефективністю симбіотичної азотфіксації штам Н-12 в симбіозі з сортами нуту Розана, Олександрит та Тріумф не поступався виробничому штаму 527, на сорті Смачний був кращим по всім симбіотичним показникам: кількості сформованих бульбочок, їх біомасі і нітрагеназній активності, забезпечивши істотне підвищення зеленої маси рослин на 29%. Ефективність симбіозу бульбочкових бактерій в польових дослідах із сортами нуту на чорноземі південному в Криму наведена у Таблиці 3. Штам Н-12 показав більшу ефективність на обох сортах нуту, ніж аналог - штам 527. Урожай зерна нуту сорту Тріумф та Олександрит, інокульованих штамом Н-12, збільшився порівняно з еталоном на 7,1 і 7,5ц/га. Збір „сирого” протеїну сорту Тріумф, інокульованого штамом Н-12 був на 281кг/га більше, ніж у варіанті із штамом 527. Таблиця 3 Варіант досліду Контроль 527 Н-12 НІР05 Контроль 527 Н-12 НІР05 Кількість бульбочок на рослину Маса бульбочок, H.A., мкМоль етилену на Урожай зер- Збір „сирого протемг/рослину рослину за годину на, ц/га їну”, кг/га Сорт Тріумф, приватне фермерське господарство 0,6 90 0,3 30,4 767 4,6 720 0,5 33,6 675 6,4 440 0,2 40,7 956 3,7 310 0,2 5,0 Сорт Олександрит, Південний філіал Кримського аграрно-технологічного університету НАУ 4,0 190 1,5 21,5 5,6 220 2,4 24,3 6,3 190 2,0 31,8 2,1 50 1,4 Продуктивність нуту сорту Колорит за умов інокуляції ризобофітом на штамі Н-12 в досліді Луганського інституту селекції і технологій (2003р.) істотно підвищилась по всім елементам структури урожаю (Таблиця 4). Таблиця 4 Варіант Контроль ризобофіт НІР05 Висота рослин, см 75,1 82,5 1,56 Маса, г зерен з рослини 5,11 8,38 0,76 Висота рослин збільшилась порівняно з контролем на 7,4см, кількість зерен з рослини - на Комп’ютерна верстка А. Крулевський 1000 зерен 226,6 257,8 3,61 Урожай, ц/га 21,4 29,2 0,62 3,3шт. та маса 1000 зерен - на 31,2г. Це дозволило отримати додатковий урожай у розмірі 7,8ц/га. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601