Штам бульбочкових бактерій bradyrhizobium japonikum m-8 kircyner, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує урожайність сої

•., i$r->* УКРАЇНА UA (11)39545 из) А (51) 7 C12N1/20, C05F11/08 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ОПИС ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видається лід відповідальність власника патенту (54) ШТАМ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ BRADYRHIZOBIUM JAPONIKUM М-8 KIRCHNER, ЯКИЙ ВИКОРИСТОВУЮТЬ ДЛЯ ПРИГОТУВАННЯ БАКТЕРІАЛЬНОГО ПРЕПАРАТУ, ЩО ПІДВИЩУЄ УРОЖАЙНІСТЬ СОЇ (21)2000105680 (22)06.10.2000 (24) 15 06.2001 (46) 15 06 2001, Бюл № 5, 2001 р (72) Толкачов Микола Захарович, Патика Володимир Пилипович, Каменева Ірина Олексіївна, Грітчіна Людмила Юрнвна (73) ПІВДЕННИЙ ФІЛІАЛ ІНСТИТУТУ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОІ МІКРОБІОЛОГІЇ УКРАІНСЬКОІ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК (57) Штам бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum М-8 Kirchner. ІСГМ УААН А63, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує врожайність сої. Винахід стосується сільськогосподарської мікробіологи, зокрема бактерій, які використовують у засобах ДПЙ підвищення врожайності t поліпшення якості зерна сої. За прототип прийнятий виробничий штам бульбочкових бактерій coi Bradyrhizobium japonicum 6346 (а.с. СРСР № 1034358, C05F11/08, C12N1/20, депонований у колекції ВНДІСГМ під номером 2490) Штам 6346 виділений із бульбочок сої сорту Колхіда 4. що вирощувалась на лугових фунта Грузи, методом аналітичної селекції1 Інокуляція насіння сої штамом 6346 сприяє підвищенню врожаю зерна на 2-10 ц/га та вмісту протеїну в ньому на 2-6%. Bradyrhizobium japonicum 6346 має такі культурально-морфолопчні ознаки Клітини мають форму паличок, розміром 2,0-3,0 х 1,0-1,2 мкм у п'ятидобової' культури Молоді клітини рухливі, монотрихи Бактероїди мають вигляд більш крупних струнких паличок. Грамнегативні. Штрих на люпиновому агарі рясний, слизуватий, білий, блискучий Культура, що повільно росте, колонії на люпиновому агарі утворюються на 7-8 добу, дрібні, до 1 мм діаметром, круглі, опуклі, білі, слизуваті. Фізюлого-біохімічні ознаки культури штаму 6346 Молоко з лакмусом не пептонизує, слабо підлужує Желатину не розріджує Аероб. Оптимум температури 26-28°С, рН 7,0-7,2. Відношення до джерела вуглецю. Bradyrhizobium japonicum 6346 використовує багато які вуглеводи з підлужуванням середовища Ак тивно засвоює галактозу, рамнозу, мальтозу, глюкозу, маніт, декстрин, лактозу, слабкіше - сахарозу, дуже спабш - ксипозу Не засвоює клітковину і крохмаль Відношення до джерела азоту добре росте на середовищах з азотнокислим натрієм, амонійними солями, тирозином На м'ясопептоновому агарі (МПА) не росте Штам Bradyrhizobium japonicum 6346 має активну нітратредуктазу і відновлює нітрати Нітрогеназна активність штаму в симбіозі з рослинами сої 2,5-50 мкМоль СгКі/на 1 рослину за годину Технічним результатом винаходу є підвищення конкурентоспроможності й ефективності штаму в якості бактеріального препарату під сою, підвищення його адаптаційних властивостей. Причинами, що перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату при використанні штаму Bradyrhizobium japonicum 6346, є невисока конкурентоспроможність у грунтах із грунтовою популяцією соєвих ризобій, значне варіювання ефективності симбіозу з різноманітними сортами сої, а також висока вимогливість до умов культивування і збереження, що ускладнює технологію одержання високих титрів інокулюму У основу винаходу поставлена задача одержання штаму бульбочкових бактерій, спроможного більш ефективно зв'язувати азот атмосфери в симбіозі з рослинами сої, більш конкурентноспроможного і більш технологічного для ю о со 39545 виробництв біологічних добриє - бактеріальних препаратів, що підвищують врожайність сої Поставлена задача вирішена шляхом виділення з бульбочок сої, яку інокулювали Rhtzobium fredii БД-32, нового високоефективного, конкурентоспроможного штаму бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum M-8 Kirchner, ІСГМ УААН А^З, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищуг урожайність сої Виведений шляхом се'-»*! (и штам Bradyrhizobium japonicum М-8 »*зь 'аи ь.іас^ивості, що співпадають з властивостями іш аму-прототипу. Штам М-8 також виділений а >упьбочок сої методом аналітичної селекції ("Методические рекомендации для курсов повышения квалификации научных сотрудников по сельскохозяйственной м и к р о - опогии ВНИИСХМ", за редакцією Л М. Доросинськл'о, Москва, 1984 рік, 27 с.) BaKTfc-ji - палички, рухливі за рахунок монотрихальногс -.лэташування жгутиків Бактероідні форми мак-'' вигляд більш крупних паличок. Грамнегативн На твердих середовищах (соєвий агар, гороховий згар) колонії' круглі, блискучі, білі, опуклі слизчнач Аероби. За джерело азоту штам використовує деякі мінеральні форми азотнокислий натрій амонійні солі Органічний азот штам не використовує - на МПА не рос і є За джерело вуглецю штам добре використовує різноманітні форми вуглеводів фруктозу, галактозу, маніт Крохмаль не пдролізує, желатину не розріджує. Штам Bradyrhizobium japonic im М-8 також має активну нітратредуктазу і відновлює нітрати Иітрогеназна активність штамів М-8 і 6346, яку визначали методом ацетилен-редукції на газовому хроматографі 'ХРОМ-5", коливається в межах 2,5-50 мк Моль C2Hd/1 рослину за годину. Bradyrhizobium japonicum М-8, на відміну від штаму 6346, є більш конкурентоспроможнім, формує ефективний симбіоз Із більшістю сучасних сортів cot, що забезпечує стійкий попит споживачів на інокулюм нового штаму Новий штам Bradyrhizobium japonicum М-8 є більш технологічним У рідких виробничих середовищах накопичується біомаса, достатня для Інокуляції на третю добу. У штаму 6346 - тільки на четверту добу. У твердих субстратах відзначається краща адаптація в порівнянні зі штамом-прототипом, що сприяє одержанню біопрепаратів із високим титром бактерій у більш короткий термін. Штам М-8 менше вимогливий до умов збереження в препаративній формі, що збільшує термін дії біопрепарату. Зазначена перерахована вище сукупністю суттєвих ознак штаму Bradyrhizobium japonicum М 8 підтверджує можливість одержання очікуваного технічного результату. Характеристика штаму бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum М-8. Номенклатурні дані, рід Bradyrhizobium; вид Bradyrhizobium japonicum М-8, депонований у колекції Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН під реєстраційним номером А-63 у групі мікроорганізмів, цо фіксують азот. Походження штаму. Штам Bradyrhizobium japonicum М-8 було отримано у Південному філіалі Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН з бульбочок сої сорту Кріпиш, що була інокульована асоціацією різобій БД-32. Спосіб виділення Штам виділений методом аналітичної селекції в Південному філіалі Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН із свіжих бульбочок со>, вирощеної у фітотроні в Селекційно-генетичному інституті УААН, Толкачовим М 3 , Патикою В П . Каменевою 1.0 , Грітчіною Л.Ю Ними ж штам ідентифікований по визначнику Берги 19R4 року, порівняний із типовим штамом бактерій Bradyrhizobium japonicum 6346. депонованим у колекції ВНДІСХМ під № 2490. Біотехно.'іопчна характеристика. Штам Bradyrhizobium japonicum М-8 утворює бульбочки на коренях різноманітних сортів сої' і завдяки наявності ферменту нітрогенази в симбіозі з рослинами фіксує азот атмосфери, 2,6-50 мк Моль СгНі/ на 1 рослину за годину Нітрогеназна зктивність визначалася методом ацетил єн редукції на газовому хроматографі "ЧРОМ-5". Культурапьно-морфолопчні ознаки. Клітини 5-10-добовоі культури штаму М-8 мають паличкоподібну форму, розміром 0.3 х 1,2 мк, рухливі завдяки наявності джгутика, монотрихи Штам М-8 грамнегативний, спор не утворює Облігатний аероб Зростання бактерій при посіві штрихом на агаризованому гороховому і соєвому середовищі з глюкозою або манітом слабке, штрих білуватий, слизуватий Належить до бульбочкових бактерій, що повільно ростуть, тому що колонії1 з'являються на поверхні агару на 6-8 добу, мають округлу форму, до 1,5 мм у діаметрі, опуклі, блискучі, слизуваті, мопочнобілуваті Навколо колоній на агарі часто утворюється райдужний ореол Пігментація відсутня. Фізюлого-біохімічні властивості. Молоко з лакмусом штам підлужує, не пептонізує його, желатинів штам не розріджує На середовищах з органічним азотом (МПА, пептон) штам не росте, добре розвивається на середовищах з солями амонію, має активну нітротредуктазу і відновлює нітрати. Штам М-8 активно засвоює глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, маніт, дульцит. Крохмаль не гідролізує. Гарний розвиток штаму відзначається на гороховому середовищі з глюкозою у присутності сахарози Температурний інтервал росту штаму М-8 на твердих і в рідких середовищах складає 1837°С, а температурний оптимум - 25-28°С. Зростання бактерій спостерігається в діапазоні рН 4,58,5, а оптимальною для розвитку клітин штаму М 8 є близька до нейтрального реакція середовища рН 6,5-7,5. Ознаки штаму стійкі. Штам не є патогенним. Культуру зберігають на манітно-дріжджевому середовищі або на соєвому чи гороховому агарі з глюкозою і сахарозою при температурі 4-5°С. Пересівають один раз у 6 місяців. Штам утворює активні бульбочки з усіма сортами сої, що вирощуються на Україні і сортозразками дикої сої. На інших бобових культурах бульбочки не утворює Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum M-8 використовують для виготовлення торф'яних 39545 біопрепаратів для передпосівної інокуляції насіння сої Готують препарат на твердому субстраті, торф фасують у пакети по 750 грам (із розрахунку половина пакету на гектар), нейтралізують, зволожують і піддають гамма-стерилізації (доза 2-5 Мрад). Дпя інокуляції готують рідке робоче середовище, що інокулюють у залежності від обсягу - щільність посіву 0,54),8 млрд. клітин/мл. Торф Інокулюють уколом і потім витримують при температурі 15-25°С для одержання титру не менше 6 млрд. клітин/грам Для ін'єкцій готують інокуляційне середовище 50% культури, 50% живильних добавок Обробку насіння сої проводять у день посіву, а ще краще невеличкими партіями безпосередньо перед посівом Передпосівну обробку насіння біопрепаратом виконують вручну на брезенті або механічно в чистій протравлювальній машині Ручну обробку насіння торф'яним біопрепаратом з Bradyrhizobium japonicum M-9 здійснюють таким чином: на брезент насипають насіння сої в кількості, що відповідає 1 або 2 гектарним порціям висіву і обробляють робочою сумішшю препарату, яку готують шляхом розмішування гектарноі порції, наприклад 300 г, у 1,5 літрах води або розчину прилиплювача до руйнації грудочок торфу Потім насіння перемішують, по черзі піднімаючи протилежні кінці брезенту для рівномірного розподілу препарату на поверхні насіння. Оброблене біопрепаратом насіння затарюють у мішки і вивозять у поле для посіву Механізовану обробку насіння біопрепаратом здійснюють машинами дпя протруєння насіння, наприклад, ПСШ-3, ПС-10, за технологією, аналогічною технологи протруєння. Перед роботою машини необхідно старанно очистити від отруйних хімікатів, промити і знешкодити згідно санітарних правил. Дпя кращої затримки біопрепарату на поверхні насіння сої використовують припипзтелі, дозування яких диференціюється в залежності від препарату Застосовують такі водяні концентрації препаратів: 7 12% розчин барди, 1-1,5% розчин казеїну технічного, 2-3% розчин патексу або патоки, 2 2,5% розчин натрієвої солі, карбоксиметилцелюлози технічної (натрій КМЦ), дли розведення використовують зняте молоко (молочні відвійки). Зберігають препарат при температурі 8-12°С у сухому провітрюваному помешканні окремо від отрутохімікатів. Ефективність симбіозу штамів бульбочкових бактерій сої з різними сортами на звичайному чорноземі без зрошення (польовий ДОСЛІД Луганського сільськогосподарського інституту, 1992 рік) приведена в таблиці 1 Найменша істотна різниця НІР 0,5=0.6 ц/га У порівняльному сортовипробуванні дванадцятьох сортів сої' в Луганській області при відсутності в контролі бульбочок штам М-8 на сортах Людзна. Вілосніжка, Кріпиш і Юг ЗО був ефективнішим штаму 6346, сприяв істотній надбавці врожаю сої, а на інших семи сортах сої' обидва штами були у порівнянні з контролем однаково ефективні Ефективність симбіозу бульбочкових бактерій сої з різними її сортами на зрошуваному звичайному чорноземі (польовий ДОСЛІД 1991 року, м. Одеса, селекційно-генетичний інститут) приведена в таблиці 2 Найменша істотна різниця НСР 05=2,1 ц/га Штам М-8 в усіх випадках показав більшу ефективність, ніж прототип штам 6346 Ефективність симбіозу штаму 6346 і М-8 із соєю сорту Пальміра на зрошуваному південному чорноземі (із ПОЛЬОВОГО досвіду ЗАО "Партизан", Сімферопольського району, Автономно» Республіки Крим) приведені в таблиці З Ефективність функціонування симбіотичного апарата, утвореного на сої сорту Пальміра штамом М-8 вище, чим у штаму 6346. Конкурентоспроможність штамів 634Ь і М-8 на різних сортах сої по відношенню до неактивного штаму 604К (модельне дослідження на верм^купіті при співвідношенні активного і неактивного штампе 105:107 на насінину), у % активних бульбочок, показана в таблиці 4 Конкурентоспроможність штамів бульбочкових бактерій сої' значно залежить від генотипу сорту роспини-хазяїна, але для штаму М-8 на більшості вивчених сортів вказаний показник вище, ніж у шгаму 6346 Ефективність нітрагінізації сої сорту Витязь 50 на фоні ґрунтової популяції інтродуктоеаних раніше бульбочкових бактерій (із польового досліду Кримського НВО "Еліта" на зрошуваному південному чорноземі) приведена в таблиці 5. За 6 років досліджень на фоні ґрунтової попупяції соєвих різобій штам М-8 стабільно перевищував штам 6346 по ефективності симбіозу із сортом Витязь 50 на 1,7-5.3 ц/га, а в середньому на 3.4 ц/га, Таблиця 1 Сорти сої врожай зерна, ц/га Контроль 1 Штам 6346 Штам М-8 2 3 4 14,3 14,4 УНИИОЗ1 11,6 10,4 13,7 12,8 Людана 9,9 12,8 13,6 Київська 27 10,4 12,3 12,0 12,8 11,0 13,8 13,9 14,8 15,9 14,7 15,9 15,2 15,5 14,7 14,8 Терезинська 24 Білосніжка Кріпиш Аркадія одеська Світанок 39545 Продовження табл,1 1 2 3 4 Харківська 35 11,9 14,4 14,8 Белор 11,1 13,9 13,6 Юг ЗО 10,7 13,2 14,4 Юг 40 12,5 15,8 16,1 Середнє 11,4 14,3 14,7 Таблиця 2 Сорти сої Врожай зерна, nfra Контроль Штам 6346 Штам М-8 Аркадія одеська 20,5 25,1 31,0 Кріпиш 20,1 24,5 33,1 Одеська 124 18,2 25,7 30,6 Южанка 23,7 30,6 34,6 Білгородська 48 20,8 21,5 27,3 Середнє 20,7 25,5 31,3 Таблиця З Показники Штам 6346 1996 Штам М-8 1997 1997 1996 16 18 12 21 528 504 422 517 за годину 5,5 7,8 6,2 4,0 Урожай зерна сої, ц/га 26,5 30,4 27,6 31,4 9,5 12,0 10,3 13,0 КІЛЬКІСТЬ бульбочок/рослину Біомаса бульбочок, мг/рослину Нітрогеназна активність, мк Моль СгН4/1 рослину Прибавка урожаю від інокуляції, ц/га Таблиця 4 Сорт сої Штам 6346 Штам М-8 Аркадга одеська 0,3 5,7 Юг40 11,8 23,5 Чарівниця степу 63,2 65,8 Витязь 50 74,3 59,7 Пальміра 15,0 28,1 39545 Таблиця 5 РІК КІЛЬКІСТЬ буль бочкових бактерій у 1 г грунту Контроль Врожай -герма, ц/га ШтамМ-8 Штам 6346 НІР 05 1994 62 22,4 23,5 26,3 1,4 1995 85 22.7 ?4,1 29 4 1,7 1996 67 23 7 25,9 28,7 2,2 1997 144 34 2 38,8 40 5 3,6 1998 118 28,6 29,8 34.0 2,4 1999 125 27,2 29,8 33,6 2,0 Середнє 100 26,4 28,6 32,0 Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 57 - 03