Спосіб стиснення лінійних та суперспіральних молекул днк

Спосіб стиснення лінійних та суперспіральних молекул ДНК, що включає створення амінослюди з високою гідрофобністю та поверхневою щільністю 3 - P.55-66]. Зазначений метод дозволяє безпосередньо отримувати стиснуті молекули ДНК та візуалізувати їх за допомогою атомно-силової мікроскопії. За допомогою даного підходу було доведено, що молекули ДНК, іммобілізовані на слюді, частково переходять від В-конформації до А-форми ДНК. Це означає, що лінійні молекули ДНК були стиснуті приблизно у 1.1 раза. Недоліком цього методу є те, що він дозволяє здійснювати незначне (у 1.1 раза) стискування молекул ДНК, а також те, що неможливо отримати стиснуті суперспіральні молекули ДНК, які є характерними для мікроорганізмів in vivo. В основу коФігної моделі поставлено задачу стиснення лінійних та суперспіральних молекул ДНК шляхом іммобілізації молекул ДНК на поверхню амінослюди з високою поверхневою щільністю протонованих аміногруп забезпечити зменшення контурної довжини молекул ДНК, а отже, і відстані між основами уздовж осі суперспіралі порівняно з канонічною В-формою ДНК. Задача, яку поставлено в основу коФігної моделі, вирішується тим, що у відомому способі стиснення молекул ДНК на слюді шляхом створення амінослюди з високою поверхневою щільністю протонованих аміногруп, згідно з коФігною иоделлю, проводять іммобілізацію молекул ДНК на амінослюді, обробленій в газовій фазі триразове дистильованим 3-амінопропілтри-етоксисиланом (АПТЕС), та викоФігтовують такий протокол стиснення молекул ДНК: - експозиція краплі об'ємом 10мкл з розчином ДНК на поверхні амінослюди площею 1см2 - 2 хвилини; - промивання поверхні слюди ультрачистою водою об'ємом 2мл; - обдування поверхні слюди потоком інертного газу - аргоном або азотом; - інкубація зразка ДНК на слюді за тиску 30мм рт.ст. протягом 20 хвилин. Модифікована амінослюда з високою гідрофобністю та поверхневою щільністю протонованих аміногруп була отримана за допомогою наступної технології. Для аміномодифікації слюди свіжосколоту слюду інкубували у скляному ексикаторі об'ємом 2,5л, заповненому аргоном, з розчинами триразове дистильованого АПТЕС (4 години) та N,Nдіізопропілетіламіну (5 годин). Отримані за допомогою леза три листи двосторонньої свіжосколотої слюди розміром приблизно 8 см х 8 см закріплювали тримачами до скляної палочки у скляному ексикаторі. На основі вимірювання періоду напівактивности (часу, протягом якого кількість іммобілізованих молекул ДНК зменшується у два рази) стандартної та модифікованої амінослюди з високою гідрофобністю та поверхневою щільністю протонованих аміногруп (за допомогою обчислення кількості іммобілізованих молекул ДНК на одиниці площі амінослюди після зберігання амінослюди у атмосфері аргону) нами показано, що практично усі аміногрупи модифікованої амінослюди є протонованими. "Занурення" молекул ДНК у шари аміносилану на поверхні слюди забезпечує за рахунок об'ємної взаємодії не тільки значніший (порівняно з ліній 17981 4 ною взаємодією для свіжосколотої слюди в пФігутності іонів Mg2+) рівень екранування заряду негативно заряджених фосфатних груп ДНК позитивно зарядженими аміногрупами, експонованими на поверхні амінослюди, але й динамічну рухо-мість молекул ДНК. КоФігну модель ілюстровано прикладами. Приклад 1. Поверхневі властивості амінослюди з високою гідрофобністю та поверхневою щільністю протонованих аміногруп, яку викоФігтовували для отримання стиснутих молекул ДНК, проілюстровано на Фіг.1. Крапля водного розчину, яку поміщали на свіжосколоту слюду, що є гідрофільною, розтікалася по поверхні слюди. В той же час при поміщенні на поверхні стандартної амінослюди крапля розчину приймала форму еліпсоїда, а на поверхні модифікованої амінослюди - форму, наближену до кулі. Фіг.1. Крапля розчину ДНК після іммобілізації на поверхні слюди з різним рівнем гідрофобності. (а) - гідрофільна поверхня свіжосколотої слюди; (б) - гідрофобна стандартна амінослюда; (в) - амінослюда з високою гідрофобністю та поверхневою щільністю протонованих аміногруп. Приклад 2. Для детальнішого розуміння механізму еластичності ДНК, а також приймаючи до уваги те, що раніше в АСМ-дослідженнях було зафіксовано зменшення контурної довжини лінійної ДНК при іммобілізації на слюді з невисокою поверхневою щільністю заряду, нами були проведені дослідження можливості стиснення молекул лінійної ДНК. Для цього лінійну ДНК довжиною 1414 п.н. (яку отримали ампліфікацією фрагмента суперспіральної ДНК pGEMEX після рестрикції ендонуклеазою Sсa I) було іммобілізовано на свіжосколотій слюді (Фіг.2а) та на амінослюді з високою гідрофобністю та поверхневою щільністю протонованих аміногруп (Фіг.2б). Із побудованих розподілів контурної довжини візуалізованих ампліконів було визначено середнє значення контурної довжини лінійних молекул ДНК. Для молекул ДНК, іммобілізованих на свіжосколотій слюді, контурна довжина склала L=435±15нм, що відповідає відстані між основами вздовж осі спіралі Н=3.07Å. Це значення знаходиться в діапазоні міжнуклеотидної відстані для В-ДНК (3.03Å