Штам бактерій rhizobium leguminosarum bv. trifolii

Корисна модель відноситься до сільського господарства до мікробіологічних засобів підвищення продуктивності конюшини, а саме до нових штамів Rhizobium leguminosarum bv. trifolii для виготовлення бактеріальних добрив під згадану культур у. У нашій країні конюшина червона у районах із помірним і вологим кліматом є основною багаторічною бобовою культурою. Підвищення урожайності конюшини може бути здійснено завдяки підсиленню у неї процесу біологічної азотфіксації шляхом обробки насіння селекційними штамами бульбочкових бактерій, здатних формувати високоактивний симбіоз із цією рослиною. У виробничих умовах основою азотфіксуючих бактеріальних препаратів здебільшого є виробничі штами бульбочкових бактерій, перелік яких за комплементарністю до певних сортів обмежений або навіть недостатній. Відомий штам бактерій Rhizobium trifolii 1360 виділений із бульбочок конюшини лугової [Авторське свідоцтво SU 1555320 А1 5С 05F 11/08, С 12N 1/20,1983 Вежайський філіал Литовського н.-д. Інституту землеробства. А.Б. Лапинскас], що використовується для отримання нітрагіну під конюшину лугову і збільшує її врожай на 12,6 %. Серед штамів, що використовуються у країнах Західної Європи, відомий штам МЕТІ 1163 [ГДР, економічний патент N 247142 А01С1/06, А 01 N63/00, С 12 R1/41], який підвищує врожай сухої маси і сирого протеїну без додаткового внесення азотного добрива, а також штам для інокуляції білої конюшини Rhizobium trifolii ZJMeT11255 (ГДР економічний патент N266256 А01 Сі/Об ), який без додаткових добрив підвищує ви хід сухої маси і підвищує вміст азоту в рослинах у вегетаційних і польових умовах. Протягом багатьох років для виробництва нітрагіну в Україні використовуються штами R. leguminosarum bv. trifolii 3446 і 340 (ІНМІ АН Білорусі), 348а (ВНДІСГМ, Росія), які сприяють збільшенню урожайності конюшини червоної. Недоліком їх є те, що на ряді районованих в Україні сортів конюшини їх азотфіксувальна активність недостатньо висока і не завжди стабільна. Найближчим до пропонованого штаму є R. leguminosarum bv. trifolii 348а (ВЩЦСГМ, Росія), отриманий у результаті аналітичної селекції. При бактеризації штамом 348а R. leguminosarum bv. trifolii конюшини районованих сортів Дарунок і Кумач виявилось, що згаданий штам проявляє слабку вірулентність, що позначається у подальшому на ефективності утворених симбіотичних систем конюшини. У результаті це призводить до зниження ефективності і отримання нестабільного урожаю конюшини. Поряд із селекцією, спрямованою на генетичну комплементарність симбіопартнерів, доцільно проводити добір штамів бульбочкових бактерій, які б утворювали високоефективні симбіотичні системи із ширшим колом районованих сортів та були б пристосованими до екологічних умов довкілля. Задачею корисної моделі є одержання штаму бульбочкових бактерій конюшини з високою азотфіксувальною активністю і вірулентністю, який би дозволяв підсилити процес симбіотичної азотфіксації у декількох районованих сортів конюшини, підвищити їх продуктивність і покращити якість надземної маси. Ця задача вирішується завдяки запропонованому штаму Rhizobiwn leguminosarum bv. trifolii BN9. Новий штам отриманий методом гібридизації: у результаті міжродової кон'югації між штамом-донором Escherhichia coli JC 5466 і штамом-реципієнтом Rhizobium leguminosarum bv. trifolii B1 (1000)NN. У результаті ступеневого відбору за підвищеними симбіотичними показниками з-поміж інших кон'югантів був відібраний штам BN9. Особливістю штаму є те, що після зберігання протягом 10 років в умовах м узейної колекції він зберігає стабільність за генетичними маркерами (стійкість до антибіотиків), високу вірулентність і азотфіксувальну активність. Штам R. leguminosarum bv. trifolii BN9 депонований у колекції Інституту мікробіології і вірусології НАН України (м. Київ) та зберігається під реєстраційним номером 1MB В-7196. Штам характеризується наступними фізіологобіохімічними ознаками: культура бактерій швидкоросла, не спороносна, грам-негативна. Клітини мають форму дрібних паличок розміром 0,7-1,0Х2,5-3,0мкм, палички рухливі. Бактерії пігмент не продукують. Колонії помірновипуклі, слизисті, напівпрозорі з часом розростаються на поверхні агаризованого середовища. Запропонований штам є мікроаерофілом. Температурний діапазон росту: 20-28°С. Оптимальна температура росту - 27°С. Діапазон рН 6,5-7,4. Оптимальна рН-7,2. Генетичні особливості: прототроф, стійкий до ряду антибіотиків (стрептоміцину сульфат - 250 мкг/мл, канаміцину сульфат - 25мкг/мл, тетрацикліну гідрохлорид - 15 мкг/мл). Штам непатогенний. Штам ідентифікований за визначником Берги, 1980, М.: "Мир". - С. 495. Відношення до джерел азоту - культура бактерій R. leguminosarum bv. trifolii BN9 відновлює нітрати і нітрити, засвоює амонійні солі. Використовує казеїн та гідролізат лактальбуміну, має каталазну та уреазну активність (засвоює сечовину). Культура не розріджує желатину, не утворює сірководень (H2S), слабо пептонізує молоко. Відношення до вуглеводів - культура засвоює сахарозу, L-арабінозу, D-арабінозу, рибозу, D-ксилозу, Dфукозу, L-фукозу, мальтозу, галактозу, ксилозу, мелібіозу, целобіозу, фр уктозу, маніт із утворенням кислих продуктів і слабо - лактозу і глюкозу. Рафінозу, декстрин, сорбозу, L-ксилозу штам не засвоює. Полісахариди - крохмаль і глікоген не гідролізує. Із багатоатомних спиртів засвоює маніт. Не засвоює манітол, сорбітол, інозітол. Відмінним джерелом вуглецю для досліджуваного штаму є меляса. Не утворює індол, не росте на МПБ+6,5 % NaCl, має ріст на МПБ+2,5 % NaCl, добре росте на м'ясо-пептонному агарі (МЛА), на середовищі Ешбі. Ріст на м'ясопептонному бульйоні при 27°С характеризується помутнінням середовища, колір якого не змінюється. Культура добре культивується на середовищах наступного складу: гороховий агар (г/л: горох - 100, сахароза - 20,0, NaCl 1,0, агар - 15-18,0, рН 6,8-7,0. В 1 л води кип'ятити 100 г гороху протягом 30 хв, настояти 20 хв. Відвар відцідити, розчинити добавки. Стерилізувати при 1 атм 30 хв, рН 6,8-7,2. Манітно-дріжджовий агар (МДА) (г/л: К 2НРО4 - 0,5, MgSО4 ·7H2O - 0,2, NaCl - 0,1, маніт - 10,0, дріжджовий екстракт - 1,0, агар - 15,0-17,0, диет. вода, рН - 7,0. Стерилізувати при 1 атм 30 хв, рН 6,8-7,2. Синтетичне середовище 79 (г/л: К 2НРО4 - 0,5, MgSО4 ·7H2О - 0,2, NaCl - 0,1, СаСО3 - сліди, казамінокислоти (або гідролізат лактальбуміну) - 0,1 % (1 г), маніт - 10,0, агар - 17,0, диет. вода - 1 літр). С терилізувати при 0,75 атм 40 хв, рН 6,8-7,2. Має слабкий ріст на картопляному агарі. Культура добре зберігається на манітно-дріжджовому агарі (МДА, рН 7,0) або середовищі 79 (рН 7,2) під мінеральним маслом при кімнатній температурі або у холодильнику при температурі 4-5°С на цих же середовищах без масла. Пересівають 1-2 рази на рік, добавляють у середовище антибіотики - стрептоміцину суль фат - 250 мкг/мл, канаміцину сульфат - 25мкг/мл, тетрацикліну гідрохлорид - 15мкг/мл. Після 20 пересівів на середовищі 79 без антибіотиків штам R. leguminosarum bv. trifolii BN9 добре росте на цьому ж середовищі із додаванням антибіо тиків - стрептоміцину, канаміцину і тетрацикліну, утворює білуваті напівпрозорі колонії, які швидко продукують слиз. Передпосівну інокуляцію насіння проводили бактеріальною суспензією із титром 109 клітин/мл. Для її отримання штам BN9 вирощували на манітно-дріжджовому агарі при 27°С протягом 3-4 діб у пробірках. Культур у із агару змивали стерильною водою, готували густу суспензію (50 мл), якою засівали качалочні колби із 350 мл середовища. Інкубацію проводили протягом 3-4 днів при температурі 27°С і постійній аерації середовища вирощування. Для виготовлення препарату на твердому носії у пакети із перлітом (вермикулітом) (130 г/га) вводили стерильно 50мл суспензії бульбочкових бактерій штаму BN9 і поживні добавки (мелясу, кукурудзяний екстракт, глюкозу) добре перемішували. Приготовлене таким чином бактеріальне добриво витримували при кімнатній температурі (18-20°С) 10 діб. Після термостатування перевіряли титр бактерій - в 1 г бактеріального препарату на твердому носії (перліт, вермікуліт) повинно бути не менше 1-1,5 млрд. клітин R. leguminosarum bv. trifolii BN9 і проводили інокуляцію насіння. Для цього гектарну норму насіння зволожували (1-2 % води від маси насіння), рівномірно перемішували із бактеріальним препаратом, підсушували в тіні і висівали в ґрунт. Інший спосіб передбачає обробку насіння конюшини водною витяжкою із бактеріального препарату на твердому носії. Для цього 250г препарату розводили у воді і фільтрували через марлю (грубі частинки перліту таким чином відділяли від основної суспензії). Отриманою суспензією інокулювали гектарну норму насіння. Ефективність штаму R. leguminosarum bv. trifolii BN9 випробовували на сортах конюшини Дарунок і Кумач у вегетаційних (на промитому річковому піску з додаванням мінерального середовища Гельрігеля із 0,2 нормами азоту ), а також у польових умовах на темно-сірому опідзоленому (рН 5,3-5,7) ґрунті із вмістом гумусу 1,6-2,0% (Черкаська обл., 2003-2005 pp.) і на сірому лісовому супіщаному (рН 5,9-6,0, вміст гумусу 1,2-1,5%) ґрунті (Київська обл.) 2004-2006 рр). У цих ґрунта х розповсюджені досить агресивні раси спонтанних форм бульбочкових бактерій конюшини. Посів конюшини проводили у другій декаді квітня з шириною міжрядь 45 см на глибину загортання насіння 1,5-2,0см. Передпосівну обробку проводили за 1 годину до висіву насіння в ґрунт бактеріальною суспензією або препаратом на твердому носії. Насіння висівали із розрахунку 15кг/га. Азотфіксувальну активність кореневих бульбочок рослин конюшини першого та другого років вегетації визначали за відновленням ацетилену в етилен за методом Харді зі співавт. (1968) на газовому хроматографі "Chromatograph-504" із полум'яно-іонізаційним детектором. Корені із бульбочками клали у герметично закриті скляні флакони ємністю 75см 3, через гумову мембрану до них вводили 10 % ацетилену від загального об'єму. Тривалість інкубації із ацетиленом - 1 година. Розділення газів проводили на колонці (0,40х130см) із Parapak N при температурі 80°С. Як газ носій використовували азот (50 мл в 1 хв.). Об'єм проби для аналізу - 0,5-1см 3. Кількість етилену, що утворився із ацетилену під дією нітрогенази інкубованого зразка, виражали у молярних одиницях (наномолях (нмоль) або мікромолях (мкмоль) утвореного етилену на 1 рослину за 1 годину). Визначення стабільності за плазмідними маркерами стійкості до антибіотиків штаму R. leguminosarum bv. trifolii BN9 в умовах симбіозу (вегетаційний дослід) показало, що реізоляти із бульбочок 30-денних рослин конюшини першого року вегетації мають задовільний ріст на селективному середовищі із заданими концентраціями канаміцину, тетрацикліну, стрептоміцину. Результати впливу штаму BN9 на урожай зеленої маси конюшини сорту Дарунок в умовах вегетаційного досліду подані в таблиці 1. Рослини, інокульовані запропонованим штамом, за сумою двох укосів надземної маси переважали виробничий штам на 17,9 % (28,1 г/посудину). У результаті активної фіксації азоту, не лише підвищується урожай зеленої маси конюшини, а й покращується якість урожаю за рахунок збільшення вмісту в ньому азоту (табл. 1). Результати ефективності застосування запропонованого штаму BN9 у якості штама-інокулянта конюшини у різних грунтово-кліматичних зонах наведені в таблицях 2-5. В умовах польового досліду (Черкаська обл.) конюшина сорту Дарунок, інокульована штамом BN9 у перший рік вегетації перевищувала штам-стандарт за азотфіксувальною активністю у 1,4 рази (табл. 2), у другий рік вегетації - у 1,5 раз (табл. 3). Інокуляція насіння конюшини сорту Кумач штамом BN9 сприяла зростанню азотфІксувальної активності у 9,2 рази (табл. 4) порівняно із спонтанною інокуляцією і у 1,4 - з обробкою штамом 348а. Порівняно із виробничим штамом 348а, запропонований штам протягом всього періоду досліджень достовірно підвищував урожай зеленої маси конюшини сортів Кумач і Дарунок. Надбавка урожаю зеленої маси конюшини сорту Дар унок в перший рік вегетації при інокуляції новим штамом складала 31,7 ц/га (19,2 %) - за відношенням до контролю і 28,8 ц/га (17,2) - за відношенням до штаму-стандарту 348а (табл. 2). У другий рік вегетації ці величини становили відповідно 77,6 ц/га (26,0) і 51,9 ц/га (16,0 %) (табл. 3). Новий штам є високоефективним симбіопартнером і для конюшини сорту Кумач, що підтверджує приріст урожаю зеленої маси на 33,7 і 36,5 % (59,9 і 62,1 ц/га) за відношенням до контролю і на 16,3 та 16,6 % (33,3 і 33,1 ц/га) - за відношенням до рослин, інокульованих виробничим штамом 348а (табл. 4-5). Передпосівна обробка суспензією бульбочкових бактерій штаму BN9 сприяла більш ранньому (на 5 днів) проростанню насіння конюшини порівняно із рослинами обробленими виробничим штамом 348а R. leguminosarum bv. trifolii. Бактерії штаму 348а R. leguminosarum bv. trifolii. використовуються у виробничих умовах для виго товлення бактеріального добрива, оскільки мають хороші технологічні властивості. Результати, наведені в таблиці 6, свідчать про те, що запропонований штам BN9 R. leguminosarum bv. trifolii має високу технологічність і навіть перевищує штам-стандарт за основним технологічним параметром: інтенсивно розмножується на відповідних рідких середовищах і дає більш високий титр у препараті на твердому носії перліті (вермикуліті). Таблиця 1. Ефектив ність інокуляцції і азотфіксув альна активність конюшини сорту Дарунок ("в егетаційний дослід, 2003 p.) Штам-інокулянт Середній урожай зеленої маси, г/посудину Надбав ка до штаму 348a Азотфіксув альна актив ність, мкмо Вміст азоту у сухій надземній масі, % Вміст білка, % І укіс II укіс Сума г/посудину % яь C2Н4 / (рослину·год) І укіс Штам-стандарт R. 104,8±4,9 52,2±0,6 157,0 leguminosarum bv. trif olii 348a Вихідний штам R. leguminosarum 114,4±9,54 46,6±2,2 161,0 bv. trif olii B1(1000)NN Запропонований штам R. 126,30±3,02 58,4±0,7 185,1 leguminosarum bv. trif olii ВN9 НІР0,5 18,2 4,52 II укіс І укіс II укіс 1,95±0,31 2,50±0,05 2,32±0,05 15,62 14,50 4,0 2,6 2,22±0,11 2,70±0,03 2,30±0,03 16,87 14,37 28,1 17,9 3,06±0,07 3,15±0,03 ,55±0,05 0,13 19,68 15,81 0,11 Таблиця 2. Урожай зеленої маси конюшини сорту Дар унок 1-го року вегетації, 2004 р. (Черкаська обл., польовий дослід). Штам-інокулянт Урожай за повтореннями, ц/га І Контроль (без інокуляції) Виробничий штам 348а Запропонований штам BN9 НІР0,5 II ІІІ IV Середній урожай, ц/га Надбавка до контролю ц/га % Надбавка до штамустандарту ц/га % Азотфіксувальна активність, нмоль С2Н4 / (рослину·год) 149,1 175,4 162,6 173,8 165,2±6,1 117,7±22,4 163,6 194,0 164,0 150,2 168,0±9,3 363,4±38,1 197,4 205,4 200,5 184,2 196,9±4,5 31,7 19,2 28,8 17,2 513,9±49,7 28,0 Таблиця 3. Урожай зеленої маси конюшини сорту Дар унок 2-го року вегетації 2005 р. (Черкаська обл., польовий дослід). Штам-інокулянт Урожай за повтореннями, ц/га IV Надбавка до контролю ц/га % Надбавка до штамустандарту ц/га % Азотфіксувальна активність, нмоль С2Н4 / (рослину·год) І Контроль (без інокуляції) Виробничий штам 348а Запропонований штам BN9 НІР0,5 ІІІ Середній урожай, ц/га II 213,2 273,6 338,0 369,0 298,5±34,7 54,6±6,3 324,0 310,0 346,8 316,0 324,2±8,1 304,8±36,1 390,4 372,0 366,0 376,0 376,1±5,2 77,6 26,0 51,9 16,0 449,6±21,6 66,4 Таблиця 4. Урожай зеленої маси та азотфіксувальна активність конюшини сорту Кумач 1-го року вегетації 2006 p. (Київська обл., польовий дослід). Штам-інокулянт Урожай за повтореннями, ц /га, 1 укіс І Контроль (без інокуляції) Виробничий штам 348а Запропонований штам BN9 НІР0,5 II III IV Середній урожай, ц/га Надбавка до контролю ц/га % Надбавка до штамустандарту ц/га % Азотфіксувальна активність, нмоль С2Н4 / (рослину·год) 154,9 185,3 194,9 176,0 177,8±8,5 89,1±9,3 213,0 210,0 192,2 202,0 204,4±4,7 595,6±57,3 247,0 239,0 237,4 227,0 237,7±4,1 59,9 33,7 33,3 16,3 822,0±49,1 19,5 Таблиця 5. Урожай зеленої маси сорту Кумач 1-го року вегетації 2006 p. (Київська обл.) Штам-інокулянт Контроль (без інокуляції) Виробничий штам 348а Запропонований штам BN9 НІР0,5 Урожай за повтореннями, ц/га, II укіс І II III IV Середній урожай, ц/га 180,0 155,0 170,0 175,0 224,0 172,0 202,0 199,0±10,7 238,0 211,0 234,5 245,0 232,1±7,4 Надбавка до штаму-стандарту ц/га % 170,0±5,4 198,0 Надбавка до контролю ц/га % 62,1 36,5 33,1 16,6 25,8 Таблиця 6. Збереження титру штамами 348а і BN9 Rhizobium leguminosamm bv. trifolii у бактеріальному препараті залежно від часу зберігання (млрд.клітин/1 г препарату) Штами Вихідний титр Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 348а Транскон'югант BN9 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 348а Транскон'югант BN9 1,8±0,01 Тривалість зберігання (доба) Титр бактерій у препараті на перліті 10 діб 15 діб 30 діб 9,1±0,2 49,0±1,0 45 діб 72,0±2,0 86,0±1,0 3,3±0,2 16,2±1,0 52,5±1,5 Титр бактерій у препараті на вермикуліті 100,0±5,5 122,5±7,5 3,8±0,2 9,0±0,0 41,5±3,5 88,5±6,5 90,0±5,0 4,8±0,5 13,6±1,1 61,0±1,0 112,5±3,5 119,5±0,5