Спосіб кількісного визначення дегідрогеназ в печінці

Изобретение относится к биохимии и медицине и может быть использовано при проведении исследований в области нормальной и патологической морфологии для количественного определения активности дегидрогеназ гепатоцитов. Известен способ определения активности дегидрогеназ в мазках крови, основанный на цветной реакции восстановления солей тетразолия в виде гранул диформазана темнофиолетового цвета, в местах активности ферментов (А.с. СССР №1553903, кл. C01N33/68, 33/50, 1990). Однако этот способ позволяет лишь полуколичественно оценить активность дегидрогеназ и в показателях, не соответствующи х международным единицам измерения. В основу изобретения положена задача разработать способ количественного определения дегидрогеназ в печени, позволяющий ускорить анализ, объективизировать его результаты и привести их в соотве тствие с международными единицами измерения. Сущность изобретения заключается в том, что цитохимическое определение дегидрогеназ проводят в клеточной суспензии печени по количеству образовавшегося продукта специфической реакции за единицу времени на единицу общего белка в клетке при данной температуре (37°C). Основным отличительным признаком предлагаемого способа является то, что он позволяет дать количественную оценку активности ферментов в общепринятых международных единицах измерения, кроме того, цитохимический анализ проводят не в мазках биосубстрата, а в клеточной суспензии и не по процентному содержанию активно реагировавших клеточных элементов, а по количеству образовавшегося продукта специфической реакции за единицу времени на единицу общего белка в клетке при данной температуре. Способ осуществляется следующим образом. Соответствующие навески (100мг) ткани печени, хранящиеся в чашках Петри на ледяной бане, переносят в сухой стеклянный гомогенизатор с тефлогеновым пестиком после предварительного грубого измельчения ножницами или скальпелем и производят щадящую гомогенизацию несколькими качающевращающими движениями пестика на холоду (температура тающего льда дистиллированной воды). Затем в гомогенизатор добавляют 5,0мл фосфа тного буфера с pH = 7,4 и эту смесь после интенсивного 3-кратного встряхивания фильтруют через два слоя марли и готовят клеточную суспензию с концентрацией клеток не менее 4 ´ 10-12/л путем двух-трехкратного отмывания клеток в буферном растворе и инкубируют 1мл полученной взвеси клеток в инкубационной среде, содержащей фосфатный буфер (pH = 7,4), субстрат окисления, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) и п-нитротетразолий (п-НТФ), после чего из суспензии клеток после центрифугирования их при = 70 определяют фотометрически содержание продукта реакции диформазана в миллиединицах за единицу времени на единицу массы белка в одной клетке при постоянной 37°C температуре. Результаты определения активности сукцинат дегидрогеназы (К.Ф. 1.3.99.1) в гепатоцитах интактных крыс при подострой интоксикации хлоридом свинца предлагаемым и известным способами представлены в таблице. Как видно из таблицы, в известном способе в итоге получают среднее число гранул диформазана в клетках при подсчете 50 клеток, т.е. косвенное определение активности фермента. Предлагаемым способом происходит прямое определение образовавшегося продукта, выраженное в молях в единицу времени и на единицу массы белка при определенной температуре. Кроме того, здесь не исключается и качественная оценка локализации центров активности в гепатоцитах. При проведении большого числа анализов этот способ значительно экономичнее известных. Таким образом, положительный эффект от использования предлагаемого способа заключается в экономии времени при анализе, объективизации результатов анализа и сопоставимости результатов с международной системой измерения. Способ весьма прост и удобен при использовании в практике экспериментальных и клинических исследований функции печени.