Штам гриба rніzорus сонnіі веrl. ет dе тоnі vаr. мf n 1393 – продуцент ліпази

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству ферментов, и представляет собой новый штамм гриба Rhizopus cohnii Berl. et de Топі var. MF № 1393 - продуцент экзолипазы, способным ч гидролизу молочного жира, который может быть использован в молочно-жировой промышленности при переработке молока для производства биологически ценных массовых продуктов питания; для получения разнообразных композиций жирных кислот и их производных на основе растительных масел и животных жиров, в технологии сыроделия; для разработки кормовых добавок; при утилизации молочножировых отходов. В связи с плохой усвояемостью молочного жира существует необходимость в повышении переваримости липидов молока (триглицеридов, фосфоглицеридов, сфингозидов). Не вызывает сомнения актуальность получения низкокалорийных полиненасыщенных жиров на основе модификаций молочного жира, производства биологически ценных продуктов, особенно для детского и диетического питания, с различным набором формирующи х и х органолептические свойства жирных кислот [1]. Проблема утилизации жиробелковых отходов пищевой промышленности, в частности молокоперерабатывающей, содержащих до 90% (по сухому весу) жиров, неразрывно связано с защитой окружающей среды от антропогенных воздействий. В природных условия х период биодеградации жировых отходов естественным биоценозом длится около 10 лет. Микробиологическая очистка таких стоков с использованием ферментов и специализированных культур микроорганизмов обеспечит возможность перехода к созданию безотходных те хнологий в пищевой промышленности [2]. Гидролитическое расщепление пищевых жиров, в том числе молочного жира, и масел может происходить в результате активности как экэо-, так и эндолипаз микробного происхождения [3]. Роль липолиза заключается в образовании вкусо- и ароматообразующи х компонентов - жирных кислот и их производных. Действие специфических и неспецифических липаз микроорганизмов обуславливает набор выделяющихся свободных жирных кислот, что определяет органолептические свойства и биологическую ценность пищевых продуктов [4]. Задача изобретения - получение нового штамма гриба - продуцента экзолипазы, способной к гидролизу молочного жира. Поставленная задача решается тем, что в качестве продуцента липазы используется штамм гриба Rhizopus cohnli Beri. at de Топі var. MF № 1393. Культура Rhizopus cohnH Berl. et de Tonl var. MF № 1393 получена двухступенчатой физиологической адаптацией к субстрату известного штамма Rhizopus cohnli Beri. Et de Топі № 61252 [5] с липолитической активностью культуральной жидкости (к. ж.) 600™ 700 ед. мл путем отбора колоний, выросших на агаризованной минеральной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода молочный жир. Наиболее активные варианты многократно пересевались на среды, содержащие в качестве источника азота казеин, а в качестве источника углерода - молочный жир и жиросодержащие отходы заводского цеха до производству плавленных сырков. Полученный новый вариант гриба, адаптированный к жировой (содержащей около 25% олеиновой кислоты) и белковой (представленной мицеллами казеина) частям молока [1], дает высокие показатели липолитической активности на оптимизированной питательпой среде с казеином и растительным маслом. В процессе роста на среде, содержащей казеин, штамм гриба R. cohnii var. MF Ns 1393, по-видимому, под действием собственных вн утриклеточных протеаз расщепляет казеин до олигопептидов и аминокислот. Экспериментально подтверждено отсутствие необходимости дополнительного внесения солей кальция и фосфора в среду для кульмвирования селекционированного варианта гриба, ввиду высокого содержания кальция и фосфора в самом казеине. Учитывая полученные результаты, разработана новая малокомпонентная среда, содержащая казеин и подсолнечное масло. Одним из достоинств штамма является способность к образованию при культивировании на среде с казеином мицелиальных шариков - пеллет, что значительно упрощает отделение культуральной жидкости от биомассы. На средах с соевой мукой - богатейшим источником азотистых веществ, содержащих до 40% белка и до 22% жира [6], величина липолитической активности культуральной жидкости и предлагаемого штамма составляет около 2500 ед/мл. Использование Rhizopus cohnii Berl. et de Топі var. MF № 1393 в сыроделии позволит получить новые сорта сыра, сократить продолжительность его созревания, разработать новые грибные закваски, расширить круг традиционно применяемых агентов созревания сыров. За рубежом для изготовления мягких сыров (камамбер) и голубых сыров (рокфор) применяются микроскопические грибы - PeniciIlium camemberti, Geotrichum candidum u P. roqueforti [1,3, 7]. Весьма существенно и го, что молочнокислые бактерии, используемые в пищевой технологии, как правило имеют низкий уровень липолитической активности и эффективнее воздействуют на жир, уже подвергшийся частичному гидролитическому расщеплению. Предварительное внесение ферментного препарата липазы грибного происхождения позволит обеспечить направленное стимулирование липолиза под действием ферментных систем молочнокислых бактерий. Как теперь установлено [1], продукты расщепления казеина - пептиды и аминокислоты - выполняют роль факторов роста для молочнокислых бактерий, участвующи х в процессах созревания такого биологически ценного и высокопереваримого продукта, каким является сыр. Перспективна также разработка кормовых добавок для животноводства с использованием предлагаемого штамма. Что касается перспектив применения предлагаемого штамма для утилизации отходов пищевой промышленности, то при его культивировании на водопроводной воде с добавлением 5-10 об. % жиробелковых отходов заводского цеха по производству плавленных сыров, потребление их составило 50-70 % с уровнем накопления биомассы 16-20 г/л. Биомасса, образующаяся в процессе безотходного производства препарата липазы и являющаяся богатым источником белка, витаминов, аминокислот, ненасыщенных жирных кислот, может быть использована в качестве кормовой добавки в животноводстве и звероводстве. Добавка биомассы в состав комбикормов улучшит переваримость и качество корма, заменит белок животного происхождения. Культурально-морфологические свойства штамма. На агаризованных питательных средах - сусло-агаре, картофельно-дрожжевом агаре при 37°С растет быстро, дает хорошее спороношение, образует колонии рыхловойлочные до низкопушисты х, вначале серые, затем дымчато-серые. В зависимости от условий культивирования для гриба характерны две формы роста: диффузная (гифальный рост) и пелленная (рост в виде мицелиальных шариков). Ризоиды хорошо выраженные, простые или слабо разветвленные, светло-коричневатые. Спорангиеносцы неразветвленные, прямые или слабо изогнутые, образуются на столонах, отходят по 1-3 от шейки ризоида или столоновидных ги ф, 83-520 и 5-13 мкм. Спорангии 45-90 мкм в диаметре. Спорангиеспоры эллипсоидальные, округлые, 4-6 мкм в диаметре, гладкие бледно-голубоватые. Хламидоспоры цилиндрические, шаровидные 15,6-21,3 · 10,1-15,4 мкм. Штамм подвергнут рассеву с выделением моноконидиальной культуры. Физиолого-биохимические свойства штамма. Аэроб, гетеротроф, растет в широком диапазоне рН 2-9. В погруженной культуре на разработанных средах отличается низкой спорообразующей способностью. Гриб термотолерантный с температурными границами роста от 17 до 52°С. Оптимальная температура роста 40-45°С, биосинтеза липазы 38-40°С, рН6-7. В качестве источников углерода усваивает глицерин, ксилозу, галактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, сорбозу, мальтозу, лактозу, декстрозу, сахарозу, крахмал, инулин, сорбит, маннит; этанол и метанол - слабо. Использует соевое, подсолнечное, рапсовое, оливковое, косточковое, кукурузное, хлопковое масла, маргарин, молочный и кашалотовый жиры. Усваивает нитратный, нитритный, аммонийный азот, предпочтительнее - органический. Ассимилирует аминокислоты, мочевину, пептон, кукурузный экстракт. Дезаминирует триптофан, метионин, фенилаланин, лейцин. Развитие штамма стимулируют дрожжевые автолизат и экстракт. С помощью присущих грибу ферментативных систем он активно участвует в процессах расщепления казеина, соевого белка. На среде с соевой мукой характер роста гриба диффузный, на среде с казеином наблюдается рост в виде пеллет. Признаки штамма устойчивы. Штамм атоксичный, не подвержен лизису, устойчив к антибактериальным веществам, не продуцирует в неклеточную протеазу. Культура обладает стабилизированной устойчивостью по активности фермента липазы. Первый этап адаптации штамма к усвоению белково-жирового комплекса молока заключался в многократном пассировании исходного штамма на среде, содержащей в качестве источника азота казеин (1%), а в качестве источника углерода - подсолнечное масло (1%). Инокулят выращивали на среде следующего состава (%): вытяжка из пшеничных отрубей - 10,0; сахароза - 1,0; К2НРО4 - 0,2; КСІ - 0.05; СаСО3-0,05; MgSO4-0.05; ΝΗ4ΝΟ3-0,03. В процессе десятикратных пересевов на указанную среду селекционирован вариант, адаптированный к белковой части молока, накапливающий биомассу в количестве 12,0 г абсолютно сухого вещества (а. с. в )/л с липолитической активностью к. ж. 1200 ед/мл. Полученные показатели превышают таковые в сравнении со значениями у исходного штамма соответственно в 1,7 и 2,0 раза (табл. 1). На втором этапе адаптации использовалась среда состава: казеин - 1 %, молочный жир - 1 %, водопроводная вода - остальное. В результате 10-кратных пересевов варианта, полученного на первом этапе адаптации к белковой части молока, селекционирован вариант, адаптированный к жировой части молока, накапливающий биомассу на уровне 14,4 г а. с. в./л с липолитической активностью культуральной жидкости 410 ед/мл (табл. 2). Изобретение поясняется следующими примерами. Пример 1. Культивирование продуцента экзолипазы Rhizopus cohmii Berl. et de Топі var. MF №1393 проводят на качалках с 220-240 об/мин при 38-40°С на новой малокомпонентной среде состава, (%): казеин 1,0; подсолнечное масло - 1,0; (величина рН после стерилизации 6,7 ± 0,1) по 150 мл в колбах емкостью 750 мл. Посев 5-ю процентами односуточного инокулюма, полученного на молочной сыворотке с рН 6,0-6,4; длительность ферментации 52-56 час. Липолитическая активность к. ж. составляет 800-1000 ед/мл. Пример 2. Культивирование продуцента производилось на качалках на среде, аналогичной примеру 1. Выращивание инокулята проводили на среде следующего состава (%): вытяжка из пшеничных отрубей -10,0; сахароза- 1,0; К2НРО4-0,2; KCI-0,05; СаСО3 - 0,05; MgSO4 - 0,05; NH4NO3 - 0,03. Липолитическая активность к. ж. составляет 1100-1300 ед/мл. Пример 3. Культивирование осуществляют в ферментере на среде по примеру 1 при 38-40°С, аэрации 1 м 3/м 3 /мин, при работе мешалки с 250 об/мин, величина рН в пределах 6,0-7,0. Инокулят выращивают по примеру 2. Липолитическая активность к. ж. составляет 1300-1500 ед/мл. Липолитическую активность определяли титрометрическим методом, модифицированным Ota Jamada (8), основанном на количественном определении свободных жирных кислот, образующихся в результате ферментативного гидролиза липидов. Липолитическая активность характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление эмульсии оливкового масла с образованием олеиновой кислоты и выражается числом единиц липазы в 1 г препарата. При этом за единицу активности принято такое количество фермента, которое ощепляет 1 микромоль (МКМ) олеиновой кислоты от 40%-ной эмульсии оливкового масла в 2%-ном водном растворе поливинилового спирта (ПВС) в стандартных условиях: температура 37°С, рН 7,0, время гидролиза 1 час. Приготовление раствора ферментного препарата. 0,1 г исследуемого препарата тщательно растирают в небольшом количестве дистиллированной воды, затем количественно переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, доводят водой до метки, перемешивают. Из этого раствора готовят ряд разведений в зависимости от предполагаемой активности препарата. При определении активности культуральной жидкости (к. ж.) ее разводят таким образом, чтобы при титровании разность между опытным и контрольным титрованием находилась в пределах от 0,7 до 1,5 мл. Аналогично и для препарата. Приготовление субстрата эмульсии оливкового масла. 100 мл оливкового масла и 150 мл 2%-ного водного раствора поливинилового спирта (ПВС) перемешивают в течение 10 мин в смесителе с числом оборотов не менее 8 тыс. об./мин. Полученную эмульсию выдерживают на холоду в течение часа. Если замечено расслаивание эмульсии, то перемешивание повторяют. Приготовление раствора ПВС. 20 г ПВС суспендируют в 800 мл дистиллированной воды. Суспензию выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, затем к суспензии добавляют 0,5 мл 1 н НСІ или 2,5 мл н НСІ, затем непрерывно перемешивают при 80-90°С в течение часа. ПВС полностью растворяется. Раствор охлаждают, рН раствора доводят до 7,0 раствором едкого натра. Затем объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой и фильтруют. Приготовление буфера Мак-Ильвейна. Буфер готовится из двухзамещенного фосфата натрия - Na2HPO4 и лимонной кислоты. Для приготовления буфера (рН 7,0) сливают-3,53 мл раствора А (0,1 Μ раствор лимонной кислоты, навеска 19,2 г) и 16,47 мл раствора В (0,2 Μ раствор Na2HPO4 12Н2О, навеска 28,4 г). Приготовление индикатора. 1 г фенолфталеина растворяют в 100 мл 96%-ного этилового спирта Техника определения липолитической активности. 2,5 мл эмульсии и 2,0 мл буфера (рН 7,0) помещают в 100 мл коническую колбу, закрывают пробкой и термостатируют при 37°С в течение 10 мин. Затем к смеси добавляют 0,5 мл раствора фермента, перемешивают и, закрыв пробкой, ставят в термостат при 37°С на 1 час. По истечении времени реакции добавляют 15 мл этилового спирта для прекращения реакции гидролиза, 0,1 мл 1 %-ного раствора фенолфталеина. Затем смесь титруют 0,05 н и раствором едкого натра (едкого кали) до розовой окраски. Параллельно ставят контроль, состоящий из 2,5 мл субстрата и 2,0 мл буфера, выдержанный при 37°С в течение часа. К смеси сразу добавляют 15 мл этилового спирта, а затем 0,5 мл раствора фермента и индикатор. Смесь титруют. Разность в титрах соответствует количеству жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при гидролизе субстрата. Активность липазы (Л. А.) рассчитывают по формуле: где а - разница между количеством щелочи, пошедшей на титрования опытного и контрольного растворов; б - концентрация (г/мл) образца в растворе фермента или объем к. ж.; F - коэффициент для щелочи; 100 - коэффициент перевода в макромоли олеиновой кислоты. За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Сравнительная характеристика исходного и адаптированного к белково-жировому комплексу штаммов представлена в табл. 3. Данные табл. 3 свидетельствуют об адаптации исходного штамма к белково-жировому комплексу молока, получению варианта с повышенной липолитической активностью, высоким выходом биомассы, селекции нового штамма гриба Rhizopus cohnil Berl. et de Топі var. MF № 1393, способного к гидролизу молочного жира. Испытание предлагаемого штамма при гидролизе молочно-жировых отходов заводского цеха по производству плавленных сыров, содержащих до 87% жира (по сухому весу), показало возможность применения штамма в процессах утилизации белково-жировых стоков.