Штам гриба аsреrgіllus nіdulаns 69 – продуцент стерігматоцістину

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма микромицета, который может быть использован для получения микотоксина стеригматоцистина, необходимого как стандарта-свидетеля при микотоксикологических исследованиях кормов, пищевых продуктов, культур микромицетов с целью диагностики и профилактики микотоксического гепатита вызванного стеригматоцистином у сельскохозяйственных животных и птицы. Известно использование штамма Aspergillus nidulans для накопления стеригматоцистина с использованием зерновых субстратов путем добавления различных добавок. Однако этот штамм обладает невысоким урожаем накапливать микотоксин в зерновых субстратах с применением добавок в концентрации от 0,7 до 1 г/кг. Задача изобретения - получение нового штамма микромицета, обладающего повышенной продуктивностью стеригматоцистина. Для решения этой задачи предлагается штамм гриба Aspergillus nidulans 69, депонирован в коллекции грибов ВНИИ антибиотиков Минмедпрома СССР под номером 336 А. Штамм выделен из корма для животных. Видовая принадлежность определена по классификации Билай В.И., Коваль Э.М. Полученный штамм Aspergillus nidulans (Eldam) Wlnt, 69 имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики. На агаре Чапека колонии быстрорастущие, на 9-10 сутки достигают 50-60мм в диам., распростертые, с тонким неровным краем, темно-салатно-зеленые. Конидиальные головки короткие, колонковидные, 60-70 х 30-35 мкм. Конидиеносцы изогнутые, с гладкой оболочкой, светло-коричневые, 75-10.0 мкм вые, 2,5-3 мкм толщ, у основания и расширяющиеся к вершине до 3,5-5 мкм апикальное расширение шаровидное, 8-10 мкм в диам. Стеригмы двухъярусные, базальные - 5-6 х 2-3 мкм, второго яруса - 5-6x2-2,5 мкм. Конидии шаровидные, 3-3,5 мкм в диам., в массе зеленоватые, слабоморщинистые. Реверзум и окружающая среда пурпурно-красных оттенков, с возрастом более темные. Оптимальная температура роста штамма 30°С, растет и при более высоких 42°С и низких до 4°С. Оптимальная температура токсинообразования 28-30°С. На естественных зерновых субстратах - пшенице, рисе, кукурузе, овсе, ячмене, ржи стеригматоцистиногенный штамм хорошо растет и продуцирует микотоксин, значительно хуже происходит накопление стеригматоцистина на жидких питательных средах Чапека, Чапека-Докса. Полученный штамм хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу и рафинозу, плохо - сорбит, малит и дульцит. Пример 1. Гриб-продуцент стеригматоцистина Aspergillus nidulans, штамм 69, выращивают на скошенном агаре Чапека в бактериологических пробирках при 30°С в течение 10-14 суток. Затем за сутки до планируемой даты заражения грибом-продуцентом зерновой субстрат - шлифованный рис помещают в матрацы емкостью 1000 см3, добавляют 80° см3 стерильной водопроводной воды, закрывают ватно-марлевой пробкой, обвязывают пергаментной бумагой и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 1 час. После стерилизации проводят заражение рисового субстрата. В качестве инокулята используют 10-14-ти суточную культуру Aspergillus nidulans, штамм 69. На один матрац с субстратом используют одну пробирку с культурой. В пробирку с культурой добавляют 5 см3 стерильной водопроводной воды и пипеткой соскабливают мицелий с поверхности культуры при этом тщательно перемешивают с водой элементы гриба. Полученную водную взвесь вносят в матрац со стерильным рисом, тщательно встряхивают и помещают в термостат при 30°С в течение 14 суток, Содержание стеригматоцистина определяют согласно "Методики определения стеригматоцистина в зернофураже, продуктах его переработки и комбикормах", утвержденной Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 11 апреля 1964 года. Из одного килограмма рисового субстрата после указанного выше токсинообразования образовался стеригматоцистин в количестве выше 2 г/кг (2-2,5 г/кг). Пример 2. Содержание стеригматоцистина определяли по кристаллическому выходу препарата. После биосинтеза гриба-продуцента на зерновом субстрате, извлечению стеригматоцистина из нативной культуры производили трехкратной экстракцией хлороформом с последующим концентрированием. Выделение токсина из экстракта включало очистку путем жидкость-жидкостного распределения в системе ацетонитрилгексан с последующей переэкстракцией токсина в хлороформ, обезвоживанию, упариванию, осаждению на минимальный объем силикагеля и хроматографию на колонке. В качестве неподвижной фазы был избран силикагель марки Л 100/400 мкм, а в качестве подвижной - гексан-этилацетат (4:1) со скоростью элкирования 5-6 см3 в мин. Содержание стеригматоцистин фракции объединяли и проводили кристаллизацию микотоксина при комнатной температуре. Кристаллы промывали охлажденной системой гексан-этилацетат и выдерживали в эксикаторе над безводным хлористым кальцием в течение двух суток в темноте. Выход при этом стеригматоцистина составил 2,3 г/кг субстрата.