Ізолят лі-1 як продуцент антигену вірусу інфекційного бронхіту курей (родина coronaviridae, coronavirus)

Ізолят ЛІ-1 як продуцент антигену вірусу інфекційного бронхіту (Infection bronchitis virus) курей (родина Coronaviridae, Coronavirus), що зберігається в лабораторії вірусології наукововиробничого центру птахівництва Луганського національного аграрного університету, м. Луганськ. (19) (21) u200613813 (22) 25.12.2006 (24) 10.09.2007 (46) 10.09.2007, Бюл. № 14, 2007 р. (72) Пархоменко Людмила Іванівна, Ігнатов Микола Миколайович, Нестерова Лариса Юріївна (73) ЛУГАНСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ 3 представлений віріонами овальної форми з нерівною поверхнею зовнішньої мембрани, типовими для представників родини Coronaviridae. При негативному контрастуванні в екстраембріональній рідині курячих ембріонів ізолят має діаметр 114157нм. Культуральні властивості. Ізолят ЛІ-1 репродукує в курячих ембріонах (КЕ), первинно - трипсинізованій культурі фібробластів курячих ембріонів (ФКЕ) та перещеплюваній культурі нирки зеленої мавпи (Vero). Приклад 1. Ізолят ЛІ-1 було розмножено у 911-добових КЕ при зараженні на хоріоналантоїсну оболонку (ХАО). Інфіковані ембріони інкубували при t +37°С, вологості 60-70% впродовж 5 діб. Щоденно проводили овоскопію яєць та визначали життєздатність КЕ. Загибель ембріонів в перші 24 год. після інфікування приймали за неспецифічну. У 1-му пасажі ізоляту ЛІ-1 спостерігали загибель 10% ембріонів на 4-ту добу після зараження. Ізолят ЛІ-1 індукував появу карликовості, збільшення печінки та серця, гіперемію легень у ембріонів та набряк ХАО, збільшення об'єму екстраембріональної рідини з наявністю уратів. При подальшому культивуванні означені вище патологічні явища стали більш вираженими, що призвело до загибелі 80% інфікованих ембріонів у 10-му пасажі. Інфекційну активність ізоляту визначали за методом Ріда та Менча та виражали у 50% ембріональній інфікуючий дозі (ЕІД50). Титр ізоляту ЛІ-1 після 5-ти послідовних пасажів на КЕ становив 107,0 ЕІД50/0,2мл. Приклад 2. Патогенність ізоляту ЛІ-1 визначали на курчатах 1- та 13-добового віку після 3-х та 11-ти пасажів на КЕ, відповідно. Інфікування проводили інтраназальним методом в об'ємі 0,2мл. Спостереження за клінічним станом інфікованих курчат та серологічний контроль сироваток крові щодо ВІБК здійснювали впродовж 25 діб у РНГА. Через 7 і 25 діб після інфікування проводили патологоанатомічний розтин курчат з кожної групи. РНГА ставили мікрометодом з використанням еритроцитарного діагностикуму. Титром сироватки щодо ВІБК вважали найбільше її розведення, при якому спостерігається аглютинація еритроцитів. Через 3 доби після інфікування курчат 1добового віку ізолятом ЛІ-1 захворюваність становила 70%. У курчат реєстрували пригнічення, тяжке дихання, хрипле пищання та діарею. У сироватках крові 50% хворих курчат виявлені антитіла до ВІБК, рівень яких у РНГА становив 1:8 та 1:16. При патологоанатомічному розтині хворих курчат виявлено серозний ексудат у трахеї, кровонаповнення легень та збільшення нирок. Після інфікування курчат 13-добового віку ізолятом ЛІ-1 інкубаційний період захворювання становив 24 год. Через 36 год. після інфікування у 40% курчат спостерігали пригнічення, сонливість, зниження апетиту, згодом - важке дихання (з відкритим дзьобом). Через 48 год. у курчат спостерігали підвищену збудженість та діарею. Розвиток клінічних ознак відмічали впродовж 14 діб. Серологічним контролем зразків сироватки крові курчат, проведеним у РНГА через 25 діб після інфікування, виявлені антитіла до ВІБК у 70% 26102 4 птиці у титрах 1:2-1:4. При патологоанатомічному розтині курчат через 7 діб після інфікування виявлена помірна кількість серозно-слизового ексудату у трахеї та гіперемія легень, які дещо збільшені в об'ємі. Розтин курчат, проведений через 25 діб після зараження ізолятом ЛІ-1, не виявив жодних патологічних змін. Показники захворюваності, клінічного прояву захворювання та патологоанатомічних зміни, індуковані ізолятом ЛІ-1 характерні для дії ВІБК. Приклад 3. Для розмноження та визначення патогенності ізолят ЛІ-1 культивували в перещеплюваній культурі клітин VERO. Культури вирощували у матрацах при +37°С у термостаті під кутом 5° впродовж 24-48 годин до повного формування моношару. Посівна концентрація складала 800900 тис. клітин у 1мл клітинної суспензії. Ростове середовище, складалося з двох середовищ - 199 та Іглу (1:1), з додаванням 10% сироватки крові великої рогатої худоби та антибіотиків (пеніциліну 100ЕД/мл та стрептоміцину 100мг/мл). Підтримуюче середовище було аналогічним, за винятком сироватки крові. Час контакту вірусу з клітинами становив 60хв. Для інфікування використовували культури з 100% моношаром, в які вносили по 1мл вірусоутримуючого матеріалу. Інфіковані культури клітин інкубували 60хв. при t +37°С, після чого залишки інфікуючого матеріалу видаляли і вносили підтримуюче живильне середовище. При наявності ураження 70-80% клітин моношару їх знімали з поверхні скла культурального посуду за допомогою диспергуючої суміші, яка вміщувала 0,25% розчин трипсину рН 7,4-7,6 і 0,02% розчин версену у співвідношенні 1:20. Оцінку змін проводили щодня при перегляді культури під світловим мікроскопом. Для врахування цитопатогенної дії (ЦПД) ізоляту флакони з культурою продивлялись під збільшенням окуляру х10, об'єктиву х10 світлового мікроскопу через 12 год. після інфікування впродовж 7 діб. Для одержання вірусу інфіковані клітини підлягали трьохразовому послідовному заморожуванню-відтаюванню. У перещеплюваній культурі клітин VERO починаючи з 1-го пасажу ізолят ЛІ-1 індукує появу генералізованого ЦПД за типом симпластоутворення через 96 год. після інфікування. З початку обмежується ріст крайової зони, у прикрайових зонах з'являються ділянки зближених ядер, а потім симпласти, які включали 5-7 ядер і більше. Через 48 год. після утворення, симпласти повільно дегенерують і руйнуються. При збільшенні кількості пасажів час прояву ЦПД зменшується. Інфекційна активність ізоляту після 3-х пасажів у культурі клітин VERO становила 104,59 ТЦД50/мл. Приклад 4. Вплив ізоляту ЛІ-1 на циліарний апарат трахеї вивчали на невакцинованих курчатах 3-добового віку з благополучних щодо інфекційних захворювань птиці господарств з різним рівнем материнських антитіл до ВІБК у сироватці крові. Курчат інфікували інтратрахеальним методом ізолятом ЛІ-1 в об'ємі 0,2мл. Рівень циліарної активності оцінювали впродовж 5 діб після інфікування за допомогою циліостатичного тесту. Для цього починаючи з 24 год. після інфікування проводили декапітацію 4-х з кожної групи курчат та 5 препарували трахею. Після промивання у розчині Хенксу та видалення залишків сполучної тканини, з кожної трахеї нарізали по 10 тонких кілець (3-и, з нижньої і верхньої, та по 4-й з середньої частини трахеї) хірургічними ножицями. Отримані кільця розташовували на предметному склі та перевіряють активність війок трахеї під світловим мікроскопом при збільшенні окуляра х10, об'єктива х10. Циліарну активність оцінювали за шкалою від 0 (усі війки рухомі) до 4 (усі війки нерухомі). Для всіх 10 трахеальних кілець від кожної птиці розраховували загальний циліостатичний бал, який при повному циліостазі дорівнював 40 та середній арифметичний бал для усіх 4-х курчат з кожної дослідної групи. Циліостатичний бал менше від 20 свідчив про наявність захисту птиці від даного ізоляту вірусу ІБК. У курчат, незалежно від наявності антитіл до ВІБК, через 24 год. після інфікування ізолятом ЛІ-1 спостерігалося уповільнення та повне припинення руху війок трахеї, яке продовжувалося впродовж 34 діб. В групі курчат без материнських антитіл до ВІБК, максимального значення (34,75) циліостатичний бал досяг на 2-у добу п. і., тоді як в групі курчат з материнськими антитілами до ВІБК, повного циліостазу (39,25) зареєстровано на 3-у добу після інфікування. Гістологічні зміни в трахеї, легенях та нирках курчат були визначені в момент, коли циліостатичний бал дорівнював максимального значення після інфікування ізолятом ЛІ-1. З цією метою у курчат кожної підгрупи відбирали частину трахеї, легень, нирок, які фіксували у 10% розчині формаліну і заливали у парафін. Отримані зрізи фарбували гематоксиліном та еозином. Оцінку гістологічних змін в органах курчат проводили за допомогою апаратно - програмного комплексу, до складу якого входить мікроскоп Olympus С X 41, цифровий апарат Olympus С 5050 Z, фотоадаптер, плата цифрового кодування відеосигналів та комп'ютер. У трахеї ізолят ЛІ-1 викликав набряк власно слизової оболонки, відшарування епітелію, збільшення кількості келихоподібних клітин, деструкцію та десквамацію епітелію трахеї. У легенях виявлено явище гострого венозного застою та лімфоциту інфільтрацію перібронхіальної сполучної тканини та власно слизової оболонці бронхів. Гостра застійна гіперемія та лімфоїдна інфільтрація встановлена при гістологічному дослідженні нирок курчат, інфікованих ізолятом ЛІ-1. Приклад 5. Для визначення гемаглютинуючої активності ізоляту ЛІ-1, після 4-х та 10-и пасажів на курячих ембріонах, була проведена реакція гемаглютинації при температурі 4°С, 18-22°С та 37°С, безпосередньо після обробки вірусвміщуючого матеріалу 1% розчином еритроцитів півня. Реакції здійснювали у лунках плексигласових пластин з використанням 2-кратних розведень досліджуваного матеріалу на фізрозчині рН 7,2 в однакових об'ємах (0,2мл). До кожного розведення додавали по 0,2мл 1% суспензії еритроцитів півня. Одночасно досліджували алантоїсну рідину неінфікованих курячих ембріонів, як контроль. Облік реакції проводили через 30-40хв. За титр гемаглю 26102 6 тинінів приймали розведення вірусу, яке сприяло прояву інтенсивності реакції у 2 хрести. За результатами реакції встановлено, що ізолят ЛІ-1 володіє аглютинуючою активністю незалежно від температури, проте треба відмітити, що після 10 пасажів на курячих ембріонах, рівень гемаглютинінів ізоляту ЛІ-1 дещо знизився і становив 1:8 (титр у реакції гемаглютинації), порівняно з титром після 4-го пасажу на курячих ембріонах (1:16). Приклад 6. Дослідження ембріональної розплідки ізоляту ЛІ-1 (11-й пасаж на курячих ембріонах) щодо аутентичності вірусу ІБК проводили з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Виділені зразки РНК ізоляту було використано для напрацювання кДНК, як матриці у реакції зворотної транскрипції. Реакцію ампліфікації з визначення належності РНК збудника до коронавірусу курей проводили за допомогою системи праймерів, що фланкують 320 п.н. ділянку S1 гену. Ампліфікаційний режим включав наступні цикли: ініціальна денатурація (95°С, 5хв., 1 повторення), денатурація (95°С, 1хв., 40 повторень), віджиг праймерів (56°С, 5хв., 40 повторень), елонгація (72°С, 1хв., 40 повторень), фінальна елонгація (72°С, 5хв., 1 повторення). Електрофоретичний аналіз результатів проведено при концентрації агарози у гелі 1,5% та силі струму 120В. За результатами проведеної полімеразної ланцюгової реакції встановлено, що досліджувана РНК ізоляту ЛІ-1 специфічно реагує з системою праймерів S1 на S1 ген вірусу інфекційного бронхіту курей. Приклад 7. Визначення електрофоретичних профілів ізоляту ЛІ-1 проводили за допомогою електрофорезу у поліакріламідному гелі (ПААГ), у порівнянні з вакцинними штамами 4/91, МА-5 та Н120 ВІБК. З метою очищення ізолят ЛІ-1 попередньо осаджували на 30%-й сахарозній подушці, розчин якої робили на TSE буфері (25mМ трисНСІ, 100mM NaCl, 1mМ ЕДТА (етілендіамінтетраоцтова кислота), рН 7,6) з подальшим концентруванням за допомогою центрифуги MSE Superspeed 65, ротор MSE об'ємом 6х16,5 мл. Термін центрифугування складав 1,5 год. за t +5°С та 25 000об./хв. (76 000g). Отриманий вірусний осад ресуспендірували у 0,5мл TSE буфері і використовували для електрофорезу. Горизонтальний електрофорез проводили у 2%- му ПААГ у камері LKB 2117 Multiphor ІІ (Швеція), блок постачання LKB 2197 Power supply (Швеція). До вірусного матеріалу додавали буфер в об'ємі 1:1, який включає 0,15М трис-НСІ, 1% ДСН (додецилсульфат натрію), 2% в -меркаптоетанол. Після розчину білків впродовж 10хв. за t 18-20°C, розчин інкубували 3хв. на водяній бані при 100°С, потім охолоджували і центрифугували 5хв. при 10000об./хв. Електрофорез проводили у горизонтальних поліакриламідних пластинах розміром 250х125x0,5мм після внесення 6мкл зразків вірусоутримуючого матеріалу. Градієнт пористості гелю на старті складав 4%, на фронті - 22,5%. Фіксацію зразків проводили з використанням 20% трис-СІ- оцтової кислоти протягом 20хв., фарбування - кумассібриліантовим синім впродовж 30хв. Оцінку молекулярної ваги білків здійснювали порівняно до ста 7 26102 ндарту білків (Cytochrom С, Ferritin, Chymotrypsinogen A, Ovalbumin, BSA), що підвергали електрофорезу одночасно із вірусом. Електрофорезом визначено, що до складу ізоляту ЛІ-1 та вакцинних (Н-120, Ма-5, 4/91) штамів ВІБК входять білкові фракції з молекулярною ма 8 сою від 14,5кDа до 155кDа. (Таблиця). Так, електрофорезом польового ізоляту ЛІ-1, який пройшов 11 пасажів на КЕ, виявлені білки з молекулярною масою 14,5, 25,1, 28,8, 29,5,62,4,67,0 і 99,4кDа. Таблиця Молекулярна маса білків польового ізоляту ЛІ-1 та вакцинних штамів ВІБК Штами ВІБК ЛІ-1 Н-120 4/91 Ма-5 14,5 + + 25,1 + + + + 28,8 + + + Молекулярна маса білків, кDа 29,5 62,4 67,0 + + + Встановлено, що вакцинні штами Н-120 та Ма5 містять однакові з ізолятом ЛІ-1 низькомолекулярні фракції білків (25,1 та 28,8кDа), тоді як вакцинний штам 4/91 - 14,5, 25,1, 99,4,кDа. Виділені фракції білків 25,1 та 28,8кDа, за молекулярною масою відповідають внутрішньому мембранному білку М та матріксному глікопротеїну Е1, а фракції з молекулярною масою 155кDa - поверхневому Комп’ютерна верстка А. Крулевський 77,0 + 99,4 + + 155,0 + глікопротеїну S вірусу ІБК. Вірусний ізолят ЛІ-1 інфекційного бронхіту курей має високі репродуктивні властивості і може бути використаний для накопичення вірусної біомаси, її концентрування та очистки для виробництва діагностичних антигенів та отримання гіперімуних сироваток до коронавірусу курей. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601