Ізолят лі-2 як продуцент антигену вірусу інфекційного бронхіту курей (родина coronaviridae, coronavirus)

Ізолят ЛІ-2 як продуцент антигену вірусу інфекційного бронхіту (Infection bronchitis virus) курей (родина Coronaviridae, Coronavirus), що зберігається в лабораторії вірусології наукововиробничого центру птахівництва Луганського національного аграрного університету, м. Луганськ. (19) (21) u200613927 (22) 27.12.2006 (24) 10.10.2007 (46) 10.10.2007, Бюл. № 16, 2007 р. (72) Пархоменко Людмила Іванівна, Нестерова Лариса Юріївна, Мустафа Аль Равашдех (73) ЛУГАНСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ 3 26692 4 24 години після інфікування приймали за неспеДля успішної боротьби з хворобою слід викоцифічну. При 1-му пасажі ізолят ЛІ-2 індукував ристовувати вакцини, які складаються з декілька загибель 30% КЕ на 3-4 добу після введення, карсеротипів, споріднених із варіантними штамами, ликовість 50% КЕ, набряк ХАО, збільшення кількоізольованими у даному регіоні. Така профілактика сті екстраембріональної рідини, а також гіперемію і створює у птиці тривалий і напружений імунітет до крововиливи на тілі 80% ембріонів. Загибель ембВІБК. ріонів супроводжувалась набряковими явищами в Ізолят ЛІ-2 ВІБК придатний для накопичення органах грудочеревної порожнини. Після адаптації вірусної біомаси, з метою виготовлення антигену впродовж 3-х пасажів відсоток таких патологоанадля серологічних реакцій (реакції непрямої гемагтомічних змін, як карликовість та набряк хоріоналютинації, реакції дифузної преципітації, реакції лантоїсної оболонки КЕ, інфікованих ізолятом ЛІ-2, нейтралізації), для імунізації тварин-донорів та збільшився до 100. одержання позитивних сироваток з антитілами до Інфекційну активність ізоляту ЛІ-2 визначали коронавірусу курей, а також може бути використаза методом Ріда та Менча та виражали у 50% емний у якості антигену для виготовлення вакцини бріональній інфікуючий дозі (ЕІД50). Титр ізоляту проти коронавірусної інфекції птахів. ЛІ-2 після 1-го пасажу становив 106,26 ЕІД50/0,2см3. Ізолят ЛІ-2 ВІБК було виділено від загиблої Приклад 2. Патогенність ізоляту ЛІ-2 визначаптиці 150-добового віку з наступними патологоанали на курчатах 3-добового віку після 1-го пасажу томічними змінами: збільшення нирок та селезінки, на КЕ. Інфікування проводили інтратрахеальним гіперемія легень, оваріосальпінгіт, жовтковий пеметодом в об'ємі 0,2мл. Спостереження за клінічритоніт. Результати серологічного моніторингу ним станом інфікованих курчат та серологічний господарства, якому належала птиця, свідчать про контроль сироваток крові щодо ВІБК здійснювали циркуляцію вірусу інфекційного бронхіту серед впродовж 25 діб у РНГА. Через 7 і 25 діб після інкурей. фікування проводили патологоанатомічний розтин Індикацію ізоляту ЛІ-2 проводили на курячих курчат. РНГА ставили мікрометодом з використанембріонах 9-добової інкубації шляхом послідовних ням еритроцитарного діагностикуму. Титром антипасажів суспензії патологічного матеріалу, а також тіл щодо ВІБК вважали найбільше її розведення, при інфікуванні трахеальної культури курчат. Іденпри якому спостерігалася аглютинація еритроцитифікацію проводили на основі цитопатогенної дії тів. ізоляту на курячі ембріони, результатів полімеразПісля інфікування ізолятом ЛІ-2 клінічні ознаки ної ланцюгової реакції, електронної мікроскопії та захворювання з'явилися через 12год. у 100% курсерологічних досліджень. Вірусний ізолят ЛІ-2 відчат і характеризувалися загальним пригніченням, носиться до родини Coronaviridae, род зниженням апетиту і відмовою від води. Через Coronavirus. 24год. після інфікування, у курчат відмічали важке Ізолят зберігається у морозильних шафах при дихання, хиткість ходи та водянистий пронос. Розтемпературі -20°С у вірусологічній лабораторії виток клінічних ознак спостерігали впродовж тижнауково-виробничого центру птахівництва Лугання. ського національного аграрного університету. За даними серологічного контролю, з 3-ї доби Морфологічні особливості вірусу. Ізолят ЛІ-2 після інфікування у 100% інфікованих курчат випредставлений віріонами овальної форми з нерівявили антитіла до ВПЯС у титрі 1:16, порівняно з ною поверхнею зовнішньої мембрани, типовими 1-ю добою, коли титр антитіл становив 1:2 (50%) для представників родини Coronaviridae. При нега1:4 (50%). тивному контрастуванні в екстраембріональній При патологоанатомічному розтині курчат черідині курячих ембріонів вірус має діаметр від 100 рез 7 діб після інфікування виявляли дегідратацію до 171нм. та нерівномірне забарвлення скелетних м'язів, Культуральні властивості. Ізолят ЛІ-2 репродускупчення серозного ексудату у трахеї. Розтин кує в курячих ембріонах (КЕ), первинне - трипсинікурчат, проведений через 25 діб після зараження зованій культурі фібробластів курячих ембріонів ізолятом ЛІ-2, не виявив жодних патологічних змін. (ФКЕ) та перещеплюваній культурі нирки зеленої Приклад 3. Вплив ізоляту ЛІ-2 на циліарний мавпи (Vero). У культурі клітин ФЕК цитопатогенна апарат трахеї вивчали на невакпинованих курчадія (ЦПД) ізоляту ЛІ-2 проявляється деструктивтах 3-добового віку з благополучних щодо інфекними змінами клітинного моношару після 1-го паційних захворювань птиці господарств з різним сажу через 36год. після інфікування. У культурі рівнем материнських антитіл до ВІБК у сироватці клітин VERO ізолят викликає ЦПД у вигляді генекрові. Курчат інфікували інтратрахеальним меторалізованої дрібнозернистої неспецифічної дегедом ізолятом ЛІ-2 в об'ємі 0,2мл. Рівень пиліарної нерації-клітин через 96год. та пригнічення мітотичактивності оцінювали впродовж 5 діб після інфікуної активності клітин із збільшенням кількості вання за допомогою циліостатичного тесту. Для атипових форм мітозів. Інфекційна активність віруцього, починаючи з 24год. після інфікування, просу після 3-х пасажів у культурі клітин VERO становодили декапітацію 4-х курчат з кожної групи та вить 105.25ТЦД50/мл. препарування трахеї. Після промивання у розчині Приклад 1. Ізоляцію та культивування вірусу Хенксу та видалення залишків сполучної тканини, проводили на КЕ 9-добової інкубації при зараженні з кожної трахеї нарізали по 10 тонких кілець (3-й, з на хоріоналантоїсну оболонку (ХАО) в об'ємі нижньої і верхньої, та по 4-й з середньої частини 0,2мл. Після інфікування ембріони інкубували в трахеї) хірургічними ножицями. Отримані кільця термостаті при +37°С, вологості 60-70% впродовж розташовували на предметному склі та перевіряли 5 діб. Щоденно проводили овоскопію яєць та виактивність війок трахеї під світловим мікроскопом значали життєздатність КЕ. Загибель КЕ в перші 5 26692 6 Приклад 5. Дослідження ізоляту ЛІ-2 після 1-го при збільшенні окуляра х10 і объектива х10. Циліпасажу на КЕ щодо аутентичності ВІБК проводили арну активність оцінювали за шкалою від 0 (усі з використанням полімеразної ланцюгової реакції. війки рухомі) до 4 (усі війки нерухомі). Для всіх 10 Виділені зразки РНК ізоляту було використано для трахеальних кілець від кожної птиці розраховували напрацювання кДНК, як матриці у реакції зворотзагальний циліостатичний бал, який при повному ної транскрипції. Реакцію ампліфікації з визначенциліостазі дорівнював 40 та середній арифметичня належності РНК збудника до коронавірусу курей ний бал для усіх 4-х курчат з групи. Циліостатичпроводили за допомогою системи праймерів, що ний бал менше від 20 свідчив про наявність захисфланкують 320п.н. ділянку S1 гену. Ампліфікаційту птиці від даного ізоляту вірусу ІБК. ний режим включав наступні цикли: ініціальна деУ курчат, незалежно від наявності антитіл до натурація (95°С, 5хв., 1 повторення), денатурація ВІБК, через 24год. після інфікування ізолятом ЛІ-2 (95°С, 1хв., 40 повторень), віджиг праймерів (56°С, спостерігалося уповільнення та повне припинення 5хв., 40 повторень), елонгація (72°С, 1хв., 40 поруху війок трахеї, яке продовжувалося впродовж 3вторень), фінальна елонгація (72°С, 5хв., 1 повто4 діб. рення). Електрофоретичний аналіз результатів В групі курчат без материнських антитіл до проведено при концентрації агарози у гелі 1,5% та ВІБ, максимального значення (40,0) циліостатичсилі струму 120В. ний бал досяг на 1-у добу після інфікування, тоді За результатами проведеної полімеразної лаяк в групі курчат з материнськими антитілами до нцюгової реакції встановлено, що досліджувана ВІБ, повного циліостазу зареєстровано на 3-у добу РНК ізоляту ЛІ-2 специфічно реагує з системою після інфікування. праймерів S1 на S1 ген вірусу ІБК. Гістологічні зміни у трахеї, легенях та нирках Приклад 6. Аналіз білків, що входять до складу курчат після інфікування ізолятом ЛІ-2 були визнаізоляту ЛІ-2 проводили за допомогою електрофочені в момент, коли циліостатичний бал дорівнюрезу у поліакріламідному гелі (ПААГ), у порівнянні вав максимального значення. З цією метою у курз вакцинними штамами 4/91, МА-5 та Н-120 ВІБК. чат кожної підгрупи відбирали частину трахеї, З метою очищення ізолят ЛІ-2 попередньо осалегень, нирок, які фіксували у 10% розчині формаджували на 30%-й сахарозній подушці, розчин якої ліну і заливали у парафін. Отримані зрізи фарбуробили на TSE буфері (25mM трис-НСІ, 100mM вали гематоксиліном та еозином. Оцінку гістологіNad, 1тМ ЕДТА (етілендіамінтетраоцтова кислота), чних змін проводили за допомогою апаратно рН7,6) з подальшим концентруванням за допомопрограмного комплексу, доскладу якого входить гою центрифуги MSE Superspeed 65, ротор MSE мікроскоп Olympus С Х 41, цифровий апарат об'ємом 6х16,5мл. Термін центрифугування склаOlympus С 5050 Z, фотоадаптер, плата цифрового дав 1,5год. за t +5°С та 25000об./хв. (76000g). Откодування відеосигналів та комп'ютер. риманий вірусний осад ресуспендірували у 0,5мл У трахеї ізолят ЛІ-2 викликав набряк власно TSE буфері і використовували для електрофорезу. слизової оболонки, відшарування епітелію, збільГоризонтальний електрофорез проводили у 2%-му шення кількості келихоподібних клітин. В легенях ПААГ у камері LKB 2117 Multiplier ІІ (Швеція), блок виявлено гострий венозний застій та лімфоїдну постачання LKB 2197 Power supply (Швеція). До інфільтрацію перібронхіальної сполучної тканини вірусного матеріалу додавали буфер в об'ємі 1:1, та власно слизової оболонці бронхів. Гостра заякий включає 0,15М трис-НСІ, 1% ДСН (додецилстійна гіперемія та лімфоїдна інфільтрація встановлена при гістологічному дослідженні нирок курсульфат натрію), 2% b-меркаптоетанол. Після розчат, інфікованих ізолятом ЛІ-2. чину білків впродовж 10хв. за t +18-20°C, розчин Приклад 4. Для визначення гемаглютинуючої інкубували 3хв. на водяній бані при +100°С, потім активності ізоляту ЛІ-2, після 1-го пасажу на КЕ, охолоджували і центрифугували 5хв. при була проведена реакція гемаглютинації за темпе10000об./хв. Електрофорез проводили у горизонратури 4°С, 18-22°С та 37°С, безпосередньо після тальних поліакриламідних пластинах розміром обробки вірусвміщуючого матеріалу 1% розчином 250х125х0,5мм після внесення 6мкл зразків віруеритроцитів півня. Реакції здійснювали у лунках соутримуючого матеріалу. Градієнт пористості плексигласових пластин з використанням 2гелю на старті складав 4%, на фронті - 22,5%. Фіккратних розведень ізоляту на фізрозчині рН 7,2 в сацію зразків проводили з використанням 20% однакових об'ємах (0,2 мл). До кожного розведентрис-СІ-оцтової кислоти протягом 20хв., фарбуня додавали по 0,2 мл 1% суспензії еритроцитів вання - кумассі-бриліантовим синім впродовж півня. Одночасно досліджували алантоїсну рідину 30хв. Оцінку молекулярної ваги білків здійснювали неінфікованих КЕ в якості контролю. Облік реакції порівняно до стандартних білків [Cytochrom С, Ferпроводили через 30-40хв. За титр гемаглютинінів ritin, Chymotrypsinogen A, Ovalbumin, BSA], що підприймали розведення вірусу, яке сприяло прояву вергали електрофорезу одночасно із вірусом. інтенсивності реакції у 2 хрести. Електрофорезом визначено, що до складу ізоЗа результатами реакції встановлено, що ізоляту ЛІ-2 та вакцинних (Н-120, Ма-5, 4/91) штамів лят ЛІ-2 володіє гемаглютинуючою активністю неВІБ входять білкові фракції з молекулярною масою залежно від температури, титр гемаглютинінів від 14,5кDа до 155кDa. (Таблиця 1). становив 1:16. 7 26692 Таблиця 1 Молекулярна маса білків польового ізоляту ЛІ-2 та вакцинних штамів ВІБ Молекулярна маса білків (к0а) Штами ВІБ 14,5 25,1 28,8 29,5 62,4 67,0 77,0 99,4 155,0 ЛІ-2 + + + + Н-120 + + 4/91 + -t+ + + Ма-5 + + Комп’ютерна верстка В. Мацело 8 Для ізоляту ЛІ-2 характерні білкові фракції з молекулярною масою 25,1, 28,8, 67,0 і 77,0кDa. Встановлено, що вакцинні штами Н-120 та Ма-5 ВІБ містять однакові з ізолятом ЛІ-2 фракції білків 25,1 та 28,8кDa, які за молекулярною масою відповідають внутрішньому мембранному білку М та матріксному глікопротеїну Е1. Вірусний ізолят ЛІ-2 інфекційного бронхіту курей має високі репродуктивні властивості і може бути використаний для накопичення вірусної біомаси, її концентрування та очистки для виробництва діагностичних антигенів та отримання гіперімуних сироваток до корона вірусу курей. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601