Спосіб визначення металів у біологічному матеріалі системою plasmaquant 110

Спосіб визначення металів в біологічному матеріалі системою PLASMAQU ANT 110, який 3 28092 металів в біологічному матеріалі, який містить мікро- чи нанограмові кількості окремих елементів, створює низку проблем, які в процесі роботи складно розв'язати, особливо у випадках, коли дослідження проводяться на об'єктах малих мас лімфовузли, залози внутрішньої секреції, субклітинні фракції, антигени, антитіла, циркулюючі імунні комплексі, білкові фракції крові, нуклеїнові кислоти тощо. Система Плазмаквант-110 згідно рекомендацій виробника використовується для визначення вмісту важких металів в продуктах промислового та сільськогосподарського виробництва, компонентах біосфери (ґрунтів, води, повітря). В біології та медицині кількісний аналіз металів до сьогоднішнього дня залишається однією з невирішених проблем, хоча інформація цього профілю має виключне значення в розумінні біологічних процесів та патогенетичних механізмів розвитку хвороби. Аналітична система "PLASMAQUANT-110" працює по принципу оптичного емісійного спектрального аналізу в атмосфері аргонової плазми в якій біологічний об’єкт переводиться в плазмовий стан. Система PLASMAQU ANT 110 є високочутливою і дозволяє одночасно проводити якісний та кількісний аналіз до 70 хімічних елементів в нанограмових та пікограмових кількостях . Адаптація системи PLASMAQU ANT 110 для дослідження біологічних об'єктів це багатопрофільне хіміко-технічне дослідження, яке включає всі етапи аналітичного процесу від забору зразків на дослідження, очистки посуди та реактивів до кількісного аналізу та ста тистичної обробки отриманих результатів. Принциповим завданням такого аналізу було вибрати та апробувати ті аналітичні процедури, які гарантують об'єктивність результатів отриманих при дослідженні малих кількостей біологічного матеріалу, виключивши будь-яке зовнішнє забруднення досліджуваних зразків. В порівнянні з прототипами дослідження металів на системі PLASMAQU ANT 110 рекомендованих виробниками областях є малозатратними, різко розширює діапазон досліджуваних об’єктів і характеризується високою аналітичною точністю та відтворюваністю. Приклад конкретного виконання Досліджуваний біологічний зразок повинен бути високодисперсним гомогенним розчином. Прозорі гомогенні біологічні зразки досліджуються без доаналітичної підготовки. Для твердих та порошкоподібних зразків необхідно попередньо провести доаналітичну підготовку, суть якої полягає в переведенні мінеральної золи досліджуваного зразка в гомогенну рідку фазу. В пробі, що аналізується не повинно бути грубодисперсних включень, оскільки вони змінюють процес подачі проби в атмосферу аргонової плазми і суттєво впливають на характер структури аргонової плазми. Мінералізація досліджуваного матеріалу здійснюється загальноприйнятими методами 4 "мокрого" чи "сухого" озолення (в залежності від характеру зразків). Доаналітична підготовка біологічного матеріалу закінчується одержанням прозорих гомогенних розчинів. Аналітичні процедури визначення кількісного вмісту важких металів в біологічному матеріалі можна розділити на 2 етапи: підготовчий та основний. Основною метою підготовчого етапу є вибір оптимальних параметрів дослідження, тобто, оптимальний підбір умов для атомізації кожного елемента. Такі умови досягаються шляхом підбору комбінацій висоти полум'я пальника (Н), енергії полум'я (Р) і тиску газу-носія (NEB), від якого залежить швидкість і кількість проби, що подається в пальник. Підготовчий етап слугує для якісної оцінки вмісту металів в біологічному матеріалі. Якісний аналіз проводиться на так званій "сумарній" пробі та стандартних розчинах виробництво фірми "MERCK" (Німеччина). "Сумарна" проба складається із частин однотипних проб, наприклад, крові чи печінки тощо. В подальшому "сумарна" проба відображає особливості групи проб, що досліджуються. Паралельно готуються стандартні розчини п'яти різних концентрацій. Даний етап роботи передбачає проведення різних аналітичних процедур в певній послідовності, які в кінцевому результаті дали б можливість суттєво покращити інформацію про кількісні параметри атомізації важких металів в біологічному матеріалі. Використовуючи «сумарну» пробу, стандартні розчини та „сліпу" пробу, проводиться процес сканування, тобто, вимірювання спектрів випромінювання кожного елементу при однакових умовах атомізації для визначення оптимальних кооперативних величин аналізу. Найчастіше при груповому дослідженні важких металів такими величинами були: висотаполум'я Н=3мм, енергія полум'я Р=7×250в і тиск газу NEB=130kPa. Починається це дослідження створенням файла (Sampletype), згідно якого проводиться сканування групи з 20-30 елементів при вищеописаних умовах атомізації у "сумарній" пробі та в стандартах. Якість атомізації оцінюється по формі спектру, що випромінює кожний елемент. Елементи, що мають задовільну форму піку (Фіг.1) не потребують подальшого підбору параметрів вимірювання і відокремлюються в окрему гр упу. Елементи, атомізація яких проходить незадовільно, тобто відсутні чіткі піки, потребують подальшої оптимізації умов вимірювання. У випадку відсутності чітких аналітичних піків при всіх можливих комбінаціях, оптимізація повинна проводитись шляхом підбору інших аналітичних операцій (концентрування чи розведення препарату, екстракція досліджуваного елементу специфічними розчинниками, зміною процесу мінералізації). Після проведення оптимізаційного вимірювання проводиться оцінка його результатів. Для кожного елементу підбираються оптимальні 5 28092 умови атомізації, тобто, підбираються такі комбінації показників висоти і енергії полум'я, при яких вплив "сусідніх" спектральних ліній та "шумів" є мінімальним. Правильність підбору показників Н і Р можна перевірити, провівши повторне сканування при нових (знайдених) умовах атомізації. Типова схема кількісного аналізу хімічних елементів за допомогою системи PLASMAQUANT 110 по матеріалах адаптації. Проведення кількісного аналізу складається з наступних етапів: - підготовка файлу, згідно якого буде проводитись дослідження; - вибір параметрів роботи приладу; - введення інструкції (формули) вимірювання (Evaluation instruction); - калібровка приладу; - вимірювання вмісту хімічних елементів в зразках; - розрахунок результатів вимірювання. Підготовка файлу: У файлі кількісного дослідження зразків створюється директорія, в якій формується Sampletype - для конкретного типу проб, вноситься прізвище оператора. Даний файл містить інформацію про параметри приладу, інструкції розрахунку вимірювань, аналітичні лінії, умови калібровки тощо. Вибір параметрів приладу (Device parameters). На даному етапі вводяться аналітичні лінії тих хімічних елементів, вміст яких необхідно визначити у зразках, задається час інтеграції, кількість інтеграцій зразка, час затримки зразка та енергії, час промивання пробозабірника, час перенастройки приладу по внутрішньому стандарту. Параметри приладу, при яких проводиться визначення даної групи елементів включають: Line - аналітична лінія; С/Р - канал і позиція встановлення лінії; PMTV - характеристика струму; Н - висота полум'я; Р - енергія полум'я; DL дельта лінії. Введення інструкції (формули) вимірювання (Evaluation instruction). Виробниками приладу запропоновано ряд стандартних інструкцій вимірювання. Вибір інструкції вимірювання залежить від аналітичної задачі, що стоїть перед дослідником, характеру зразків та Інших особливостей аналізу. Зразки стандартних найбільш вживаних інструкцій обчислення вмісту металів в біологічному матеріалі. Калібровка (Calibration). На даному етапі складається список калібровочних проб, кількість повторів вимірювання тощо. До цього списку входять стандартні розчини та "сліпа" проба. При проведенні калібровки приладу виконується вимірювання стандартних розчинів та "сліпої" проби і будується калібрувальний графік (Фіг. 2). Калібровка вважається задовільною, коли встановлена лінійна залежність між концентрацією та екстінкцією, а цифрові значення відносної похибки не виходять за межі допустимих. Якість калібровки можна оцінити шляхом побудови різних 6 моделей графіків та оцінки різних коефіцієнтів залежності, зокрема, співвідношення між заданою концентрацією металу (Ссаlс) та відтвореною аналітичною системою (Cchem) (Фіг.2). Адаптація аналітичної системи PLASMAQU ANT 110 проведена на зразках крові 26 донорів, в яких досліджено есенціальні (Fe, Cu, Mn, Zn, Cr, Co), умовноесенціальні (Sr, Ni), метали-токсиканти (Cd, Pb). В результаті тривалого підбору умов сканування вдалося підібрати параметри, при яких вдалось отримати чіткі аналітичні піки для досліджуваних металів (див. додаток). При якісному аналізі донорської крові на наявність есенціальних, умовноесенціальних металів та металівтоксикантів вдалось отримати чіткі аналітичні піки, що дає підстави використати систему PLASMAQU ANT 110 для кількісного дослідження важких металів в крові людини. Дослідження вмісту металів в тканинах експериментальних тварин (щурі, миші, кролики), рослин показали придатність цієї системи для дослідження вмісту важких металів з концентраціями нанограмових величин. Результати експериментальних досліджень біологічного матеріалу дали підстави розробити оптимальні умови, підібрані фізичні параметри роботи системи PLASMAQU ANT 110, які дозволили рекомендувати аналітичну систему PLASMAQU ANT 110 для дослідження вмісту важких металів в біологічних зразках, які не перевищують нано - та мікрограмових кількостей. Джерела інформації: 1. Kerstan F., Notzold C. Bestimmung von Schwerenmettalen in Abwasser mit dem PLASMAQU ANT 100/110. - Zeiss Analysentechnick, 199 - pp.2-13. 2. Yungel V., Notzold C., Weniger K. Compensation of spectral interferences by example of Cadmium and Arsenic at 238.8 nm. - Zeiss Analytical Technology, 1995. - 9-17. 3. Мазепа A.I., Мазепа I.B. Використання плазмової спектрофотометрії для дослідження металів в біологічному матеріалі. - Медична хімія. 2000. - т.2, №3. - с.72-75. 7 28092 8