Спосіб прогнозу дії антиоксидантів

Спосіб прогнозу дії антиоксидантів шляхом дослідження крові, що відрізняється тим, що виділяють лімфоцити пацієнта, визначають у них рівень антиоксидантного захисту за індексом хемілюмінесценції до і після додавання ініціюючої системи і при перевищенні показника в 1,5 рази вище контрольних значень прогнозують імуносупресивну, а при значеннях нижче 1,5 - стимулюючу дію антиоксидантів на імунологічну реактивність організму. (19) (21) 98063030 (22) 11.06.1998 (24) 15.12.2000 (33) UA (46) 15.12.2000, Бюл. № 7, 2000 р. (72) Яценко Валентин Порфирійович, Афоніна Галина Борисівна, Русин Олена Валеріївна, Варус Василь Іванович, Білий Олександр Володимирович (73) Яценко Валентин Порфирійович, Афоніна Галина Борисівна, Русин Олена Валеріївна, Варус 30856 ченнях нижче 1,5 - стимулюючу дію антиоксидантів на імунологічну реактивність організму. Порівняння запропонованого способу з прототипом дозволяє встановити його відповідність критерію "новизна", оскільки вперше проводиться підбір антиоксидантів методом хемілюмінометрії, що прямо характеризує початкові (а не кінцеві, як у прототипі) етапи процесів вільнорадикального окислення (а не тільки ПОЛ, як у прототипі); дослідження вперше засноване на індивідуальній оцінці антиоксидантної стійкості максимально важливих у регуляції гомеостаза клітин-лімфоцитів (а не сироватки крові), запропонована формула, що відбиває позитивний і негативний варіанти відповіді і полегшує аналіз отриманих результатів, що не було раніше заявлено і забезпечує відповідність критерію "новизна". Що стосується дотримання критерію "суттєві відмінності", можна сказати, що запропонований спосіб розширює рамки оцінки препаратів: передбачає, по-перше, можливість саме прогнозу дії антиоксидантів в організмі, зокрема на імунологічну реактивність, по-друге, саме індивідуального прогнозу і, окрім того, заснований на використанні найбільш адекватних завданню прямих автоматизованих, простих методів виміру. Доцільність використання хемілюмінометрії і показника антиоксидантної стійкості лімфоцитів визначається необхідністю уніфікації, спрощення, підвищення інформативності, точності і створення експрес-методу прогнозу й оцінки індивідуальної дії антиоксидантів в організмі пацієнта. Експреспрогнозування в нашому способі забезпечується використанням хемілюмінометрії і формули для розрахунку ефекту дії антиоксидантів в організмі. Метод не потребує дорогих реактивів, складається з 2-х етапів, а не з 4-х, як у прототипі, і потребує на проведення 40-60 хвилин, а не 2-3 години, як у відомому раніше рішенні. Таким чином, запропонований спосіб подає новий підхід до вирішення поставленого завдання - індивідуальний прогноз дії антиоксидантів, зокрема на імунологічну реактивність організму. Він має переваги у порівнянні з прототипом, скорочує терміни і зменшує вдвічі етапи дослідження, заснований на прямих автоматизованих вимірах показника найбільш адекватного і функціонально важливого об'єкта - лімфоцитів пацієнта, передбачає використання спрощеної формули з індексуванням показників і урахуванням усіх можливих їх варіантів, що дозволяє відразу оцінити кінцевий результат. Групи обстежуваних Контроль показників Здорові особи 1. Б-ко а и 2. Х-ов а и 3. П-ов а и З огляду на широке поширення і рекламу антиоксидантних препаратів, застосування їх населенням може бути необгрунтованим і призводити до небажаних ефектів. Останнім часом отримані дані про те, що при певних ситуаціях антиоксиданти можуть призводити до переобтяження деяких захворювань, у тому числі до пригнічення імунної функції (Natural antioxidants in human health and disease / Balz Frei. Acad. Press: N.Y. London. Tokyo. Toronto, 1994. - P. 411-445). Доцільно розробити способи підбору й об'єктивні показники для індивідуального використання тих чи інших антиоксидантів у профілактиці і лікуванні різних захворювань. Наш спосіб призначений для об'єктивного прогнозу дії антиоксидантів у конкретного пацієнта. Спосіб здійснюється таким чином. З 2-х мл гепаринізованої крові обстежуваного виділяють лімфоцити, доводять їх концентрацію розчином Хенкса з рН 7,2 до 4 млн в 1 мл і вносять по 0,5 мл у кювети хемілюмінометра з 0,2 мл люмінола, у робочому розведенні 4 мкг/мл. У 1-шу кювету вносять 0,1 мл антиоксиданта в розведенні, що відповідає терапевтичній дозі в розрахунку на 2 млн. лімфоцитів, інкубують проби в темноті 20 хвилин при 37°С. Рівень АОС в лімфоцитах вимірюють по відношенню періоду індукції люмінолзалежної хемілюмінесценції після додавання 0,1 мл 3% розчину гідроген пероксида за формулою: К/ХЛо-ХЛк>1,5, де ХЛо - період індукціїсвічення в досліді; ХЛк - період індукції свічення в контролі; К=4, коефіцієнт перерахунку еталонного показника при нижньому рівні виміру ImV і хемілюмінесценції еталоні ясності більше 1600 імп/сек. При значенні у формулі більше 1,5 прогнозують імуносупресивну дію антиоксидантів на імунну відповідь. При показнику менше 1,5 прогнозують відсутність імуносупресивної або імуностимулюючої дії препарату на імунологічну реактивність організму. Переваги запропонованого технічного рішення в порівнянні з прототипом. При проведенні порівняльних досліджень дії альфа-токоферола (а) та іонола (і) нашим способом і способом прототипу у порівнянні зі станом імунологічної реактивності організму, котру оцінювали за рівнем функціональної активності лімфоцитів у пацієнтів з ішемічною хворобою серця (ІХС) або осіб, що піддавалися впливу іонізуючої радіації-ЛНА, встановлено: Спосіб прототипу Рівень МДА ДНК в лімфоцитах, сив. -6 2 10 М/мл mV/mkm 0,72+0,04 1,1+0,01 Запропонований спосіб ДНК в лімПоказник АСУ, фоцитах умовн. од. 2 mV/mkm 1,0+0,03 1,1+0,01 АОС 0,87 0,75 0,64 0,92 0,43 0,64 АОС и n в в вв в 1,23 1,05 0,89 1,11 1,15 1,15 2 1,23 1,12 1,52 1,34 0,95 1,23 в n вв в n в 1,23 1,05 0,89 1,11 1,15 1,30 30856 Продовження Групи обстежуваних 4. Н-да 5. Р-ль Хворі ІХС 1. И-ко 2. Ф-ко 3. С-ль 4. В-ва 5. Д-ий 6. С-ко ЛНА на ЧАЕС 1. С-ль 2. Б-ич 3. Р-н 4. П-ко 5. Д-ов а и а а Спосіб прототипу Рівень МДА ДНК в лімсив. фоцитах, -6 2 10 М/мл mV/mkm 0,67 n 1,11 0,57 в 1,28 0,46 вв 1,26 0,61 в 1,06 Запропонований спосіб ДНК в лімПоказник АСУ, фоцитах умовн. од. 2 mV/mkm 1,14 n 1,11 0,81 п 1,28 0,89 п 1,26 1,01 n 1,06 а и а и а и а и а и а и 0,97 0,61 0,52 0,46 0,82 0,68 0,36 0,68 0,59 0,43 0,55 0,62 n в в вв в в вв в в вв в в 0,78 1,12 1,1 0,73 0,83 0,84 1,14 0,67 1,19 0,95 0,87 0,99 1,66 1,4 1,47 1,52 1,53 1,59 1,12 1,67 0,76 0,92 1,5 1,46 вв в в вв вв вв в вв пп n вв в 0,78 1,12 1,1 0,73 0,83 0,84 1,13 0,67 1,19 0,95 0,87 0,99 а и а и а и а и а и 1,1 0,62 0,60 0,71 0,96 0,54 0,67 0,55 0,57 0,61 пп в в n п в в в в в 1,24 0,77 1,17 0,83 0,58 0,97 0,81 1,45 0,72 0,84 1,25 1,51 1,34 1,57 1,57 0,3 1,5 0,72 1,61 1,5 в вв в вв вв п вв пп вв вв 1,24 0,77 1,17 0,83 0,58 0,97 0,81 1,45 0,72 0,84 де: в - вище норми; вв - значно вище норми; п - понижена, у порівнянні з нормою. and clinical indications: A second IUIS/WHO report // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1988. - V. 49. P. 478-497). Оцінка АОС за способом прототипу мала низьку точність (47% похибок) і не дозволяла вірогідно прогнозувати дію антиоксидантів на функціональний стан лімфоцитів. Таким чином, переваги запропонованого способу оцінки дії антиоксидантів: - підвищення точності дослідження; - спрощення способу; - розширення можливостей способу; - скорочення часу на проведення дослідження до 1 години замість 3-4 годин в прототипі; - стандартизація й автоматизація дослідження. Як видно з даних таблиці, непряме визначення показника антиоксидантної стійкості не завжди збігається з прямим визначенням АОС методом хемілюмінометрії за нашим способом, в прототипі похибка складає 47%, а імуносупресивний ефект препаратів за способом прототипу визначити практично неможливо. При дослідженні нашим способом імуносупресивний ефект визначається у обстежуваних при показнику АОС вище 1,5, що для спрощення позначено в таблиці як "вв". У 97% випадків "в" при наявності "вв" в графі "Запропонований спосіб" виявлена імуносупресія - зниження синтезу ДНК в лімфоцитах, що свідчить про пригнічення їх функціонального стану (Laboratory investigations in clinical immunology: methods, pitfails 3 30856 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4