Спосіб визначення антиоксидантів

Изобретение относится к аналитической химии, в частности, к методам определения органических антиоксидантов, и может быть использовано в анализе природных и сточных вод, продуктов питания, лекарственных препаратов, в медицинской диагностике, в контроле технологических процессов, в биохимических исследованиях. Антиоксиданты представляют собой широко распространенный класс соединений, которые реагируют со свободными радикалами и в результате этого замедляют различные окислительно-восстановительные процессы, протекающие с их участием. Известны различные способы определения антиоксидантов. Среди них наиболее чувствительными и простыми в исполнении являются хемилюминесцентные, особенно основанные на использовании реакций окисления люминола (3-аминофталевого гидразида). Антиоксиданты снижают скорость окисления люминола и/или скорость образования излучателя света (3-амино-фталата) в процессе этого окисления, что сопровождается ослаблением хемилюминесценции. Степень тушения хемилюминесценции обычно пропорциональна концентрации антиоксиданта (Бабко А.К., Дубовенко Л.И., Луковская Н.М. Хемилюминесцентный анализ. Киев, Техніка, 1966, с. 37-52). Известен способ определения фенолов и ароматических аминов, основанный на использовании реакции люминола с пероксидом водорода в присутствии катализатора, например, соли меди (Попов Б.И. Игнибирование хемилюминесценции люминола некоторыми фенолами и ароматическими аминами. Автореф. дис.на соиск. учен, степени. канд. хим, наук. Львов. Госуниверситет им. И.Франко, 1969, с. 15). Способ реализуется следующим образом. Смешивают растворы люминола, соли меди, гидроксида натрия и пероксида водорода и фотоэлектрическим методом измеряют максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (Ιο). Концентрации компонентов реакции в конечном объеме (10см 3) составляют соответственно 4,8 · 10-4, 2,4 · 10-4, 2,4 · 10-2 и 7,2 · 10-3 моль/дм 3. Опыт повторяют в присутствии анализируемой пробы, измеряют интенсивность хемилюминесценции (I1). Содержание антиоксиданта в пробе находят по градуировочному графику, на оси ординат которого откладывают отношение lo/l1. Предел обнаружения 1,4-фенилендиамина составляет 6 · 10-5 моль/дм 3, пирокатехина - 2 · 10 -6 моль/дм 3. Недостатком способа является низкая чувстви тельность. Способ недостаточно универсален, так как алифатические спирты, кетоны и другие соединения определять не представляется возможным. Способ сложен в исполнении - необходимо регистрировать хемилюминесценцию, быстро меняющуюся со временем. Кроме того, определению антиоксидантов мешают соединения с комплексообразующими свойствами, которые связывают катализатор в неактивную форму, например, малые количества этилендиаминтетраацетата. Известен способ определения аскорбиновой кислоты, рибофлавина и других витаминов по ослаблению ими хемилюминесценции в реакции люминола с иодом (Луковская Н.М., Чмиленко Ф.А. Определение микроколичеств тиамина, рибофлавина, фолиевой и аскорбиновой кислот, рутина, викасола по ингибированию хемилюминесценции// Укр.хим.журн., - 1973. - Т. 39, №6. - С. 603-609). Способ реализуется следующим образом. Смешивают растворы гидроксида калия, иода и люминола и регистрируют сумму выделенного света (So) с использованием фотопластинки. Концентрации компонентов реакции в конечном объеме (1 см 3) составляют соответственно 5 · 10-2, 7,5 · 10-6 и 1,4 · 10-5 моль/дм 3. Опыт повторяют в присутствии анализируемой пробы, измеряют сумму выделенного света (S1). Содержание витамина определяют из соотношения So/S1 по градуировочному графику. Предел обнаружения аскорбиновой кислоты составляет 1 · 10-6, др уги х витаминов - (1-2) · 10 -6 моль/дм 3. Недостатком способа является его низкая чувствительность. Способ недостаточно универсален, так как алифатические спирты, кетоны и другие соединения определять не представляется возможным. Способ трудоемкий в связи с необходимостью в использовании фотопластинок. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения фенолов и ароматических аминов по реакции люминола с гипохлоритом (Попов Б.И. Ингибирование хемилюминесценции люминола некоторыми фенолами и ароматическими аминами. Автореф. дис.канд. хим. наук, Львов., Госуниверситет им. И.Франко, 1969, с. 15). Способ реализуется следующим образом. Смешивают по 1 см 3 растворов люминола (4,8 · 10-3 моль/дм 3) и гидроксида натрия (0,8 моль/дм 3), добавляют 7 см 3 воды, 1 см 3 раствора гипохлорита натрия (0,16 моль/дм 3) и фотоэлектрическим методом измеряют максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (Ιο). Концентрации компонентов реакции в конечном объеме (10 см 3) составляют соответственно 4,8 · 10-4, 8 · 10-2 и 1,6 · 10-2 моль/дм 3. Опыт повторяют, заменяя воду на 7 см 3 раствора анализируемой пробы, измеряют интенсивность хемилюминесценции (I1). Содержание антиоксиданта находят по градуировочному графику из отношения Іo/І1. Предел обнаружения 1,4-фенилендиамина составляет 5 · 10-6 моль/дм 3, анилина - 5 · 10 -5 моль/дм 3. Недостатком способа является его низкая чувствительность. Способ недостаточно универсален, так как определение алифатических спиртов, кетонов и других соединений не представляется возможным. Способ сложен в исполнении - интенсивность хемилюминесценции быстро меняется со временем и ее максимальное значение трудно регистрировать. Из анализа известных технических решений следует, что в известных способах антиоксидантов, как мы предполагаем, не реализуются потенциальные возможности хемилюминесцентного метода анализа - эти способы недостаточно чувствительны, применимы только для определения отдельных классов антиоксидантов, сложны в исполнении. Задачей изобретения является разработка хемилюминесцентного способа определения антиоксидантов, основанного на обработке анализируемой пробы люминолом и окислителем в щелочной среде, в котором использование окислителя другой природы и специальных условий проведения реакции обеспечило бы достижение необходимого технического результата - высокую чувствительность определения антиоксидантов (низкий предел обнаружения), а также высокую универсальность (расширение функциональных возможностей) и упрощение методики определения. Поставленная задача решается способом определения антиоксидантов, включающее обработку анализируемой пробы люминолом и окислителем в щелочной среде с последующим измерением интенсивности хемилюминесценции, в котором, согласно изобретению, в качестве окислителя люминола используют пероксодисульфат, а концентрация люминола составляет (0,3-10) · 10-7 моль/дм 3. Обработку анализируемой пробы можно также осуществлять смесью люминола, пероксодисульфата и щелочи. Нами установлено, что при использовании в качестве окислителя люминола пероксодисульфата при заявляемых низких концентрациях люминола его реакция с пероксодисульфатом по своему механизму отличается от реакций с другими окислителями, например, с гипохлоритом. Люминол реагирует не с самим окислителем, а со свободными радикалами ОН, которые образуются при взаимодействии с водой продуктов самопроизвольного разложения пероксодисульфата ион-радикалов SO4-. Свободные радикалы ОН генерируются с невысокой и постоянной скоростью. Алифатические спирты, кетоны, аминокислоты и другие антиоксиданты также реагируют с этими свободными радикалами и предотвращают окисление ими люминола. Именно потому, что окислителем люминола являются очень реакционноспособные свободные радикалы ОН, расширяется круг антиоксидантов, способных к тушению хемилюминесцении. Излучатель света возникает при взаимодействии одного из промежуточных продуктов окисления люминола ион-радикала семихинона с ион-радикалами О2- - продуктами реакции семихинона с растворенным кислородом. Такие антиоксиданты, как фенолы и ароматические амины, тушат хемилюминесценцию люминола в результате реакций с ион-радикалами О2-. Они конкурируют за эти ион-радиалы, не только с семихиноном, но и с самим люминолом. Поэтому низкая заявляемая концентрация люминола обеспечивает высокую чувствительность определения антиоксидантов обоих обсуждаемых выше типов. Как показали опыты, низкая концентрация люминола сказывается положительно только при использовании его реакции с пероксодисульфатом, В случае реакций люминола с гипохлоритом и другими окислителями концентрация люминола существенно не влияет на чувствительность определения антиоксидантов. Так как люминол в заявляемых условиях окисляется очень медленно, отпадает необходимость фиксировать максимальное значение интенсивности хемилюминесценции. Она сохраняется постоянной в течение нескольких часов после смешивания растворов компонентов реакции. Появляется также возможность использования для определения антиоксидантов одного-единственного раствора, содержащего люминол, щелочь и пероксодисульфат. Таким образом, совокупность существенных признаков предложенного способа является необходимой и достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата - высокой чувствительности определения антиоксидантов при расширении универсальности способа и упрощении методики. Способ реализуется следующим образом. Смешивают растворы люминола, гидроксида калия и пероксодисульфата и измеряют интенсивность хемилюминесценции (Ιο). Опыт повторяют с добавлением раствора анализируемой пробы, содержащей антиоксидант, и измеряют интенсивность хемилюминесцении (I1). Вычисляют отношение Іо/I1 и по градуировочному графику находят содержание антиоксиданта. Заявляемая концентрация люминола в конечном объеме составляет от 3 · 10-8 до 1 · 10-6 моль/дм 3. Остальные концентрации других компонентов реакции, при которых чувствительность определения антиоксидантов при заявляемой концентрации люминола максимальна, следующие: пероксодисульфат - в интервале от 2 · 10-3 до 1 · 10-2 моль/дм 3, гидроксид калия - в интервале от 1 · 10-3 до 3 · 10-2 моль/дм 3, что соответствует рН 11,0-12,5. Если анализируемая проба содержит достаточно большие количества антиоксидантов, целесообразно измерить интенсивность хемилюминесценции предварительно приготовленной смеси растворов люминола, пероксодисульфата и щелочи (Ιο), а затем в эту же смесь ввести раствор анализируемой пробы в минимальном объеме и снова измерить интенсивность хемилюминесценции (I1). Характеристика используемых реагентов и прибора. Люминол, препарат фирмы "Sigma" (США) Калия гидроокись, ТУ 6-09-50-2322-77, ч.д.а. Калий надсернокислый (пероксодисульфат), ГОСТ 4146-74, ч.д.а. Вода дважды перегнанная с добавлением перманганата. Фотометр хемилюминесцентный с ценой деления 1 · 105 фотон/с в области спектра около 430 нм (Калиниченко И.Е., Игольников В.Ε Прибор для хемилюминесцентного анализа // Укр.хим журн, - 1973. - Т. 39. - №6. - C. 614-616). Пример 1. В кювету хемилюминесцентного фотометра помещают 4,0 см 3 воды, добавляют 0,5 см 3 раствора люминола с концентрацией 1·10-6 моль/дм 3, 0,5 см 3 смеси растворов калия надсернокислого с концентрацией 5 · 10-2 моль/дм 3 и калия гидроокиси с концентрацией 0,1 моль/дм 3. Концентрации компонентов реакции в конечном объеме (5 см 3) составляют соответственно 1 · 10-7, 5 · 10-3 и 1 · 10-2 моль/дм 3. Измеряют установившееся значение интенсивности хемилюминесценции (примерно через 2 минуты, Ιο). Опыт повторяют, заменяя воду раствором пирокатехина с содержанием его 1,38 нг, и измеряют интенсивность хемилюминесцении (I1). Рассчитывают отношение lo/I1 и по градуировочному графику находят содержание пирокатехина (a) lo = 1250 · 105 фотон/с, I1 = 700 · 10 5 фотон/с. Найдено: а = 1,32 ± 0,07 нг (табл. 1, пример 1). Пример 2. В кювету помещают 4,0 см 3 воды, растворы реагентов, описанные в примере 1, измеряют величину Io . Опыт повторяют, заменяя воду раствором пирокатехина с содержанием его 13,8 нг, и измеряют величину I1. Находят содержание пирокатехина, как описано выше. Io = 1250 · 105 фотон/с, I1 = 143 · 105 фотон/с. Найдено: а =13,4 нг (табл.1, пример 3). Пример 3. Готовят смесь растворов, содержащую калий надсернокислый при концентрации 5 · 10-3 моль/дм 3, гидроксид калия при концентрации 1 · 10-2 моль/дм 3 и люминол при концентрации 1 · 10-7 моль/дм 3. Эта смесь пригодна для использования в течение рабочего дня. Отбирают 5,0 см 3 указанной смеси, помещают в кювету хемилюминесцентного фотометра, измеряют величину Іо. В тот же раствор добавляют 0.05 см 3 раствора пирокатехина с содержанием 1,38 нг и измеряют величину I1. Вычисляют отношение lo/l1 и по градуировочному графику находят содержание пирокатехина. lo= 1245 · 105 фотон/с, I 1=706 · 105 фотон/с. Найдено: а = 1,36 нг (табл.1, пример 2). Пример 4. В кювету помещают 4,0 см 3 воды, растворы реагентов, описанные в примере 1, и измеряют величину Ι ο. Опыт повторяют, заменяя воду раствором анилина с содержанием его 46,5 нг, и измеряют величину I1 . Содержание анилина находят, как описано в примере 1. Ιο = 1260 · 10 фотон/с, I1 = 702 · 105 фотон/с. Найдено: а = 44,0 нг (табл.1, пример 4). Пример 5. В кювету помещают 4,0 см 3 воды, растворы реагентов, описанные в примере 1, и измеряют величину Ι ο. Опыт повторяют, заменяя воду раствором изопропанола с содержанием его 450 нг, и измеряют величину I1. Содержание изопропанола находят, как описано в примере 1. Io= 1240 · 105 фотон/с, І1 = 700 · 105 фотон/с. Найдено: а = 460 нг (табл.1, пример 7). Данные, характеризующие точность определения некоторых антиоксидантов доверительный интервал и относительная ошибка, а также воспроизводимость результатов относительное стандартное отклонение при n = 5 и Ρ = 0,95, приведены в табл.1, как видно из табл.1, относительная ошибка определения малых количеств антиоксидантов не превышает ±5%, относительное стандартное отклонение результатов измерений составляет 2-5%. Эти показатели соответствуют предъявляемым к подобного рода методикам. Заявляемый интервал концентраций люминола выбран из условий, обеспечивающих максимальную чувствительность определения антиоксидантов различных классов, Как следует из данных, приведенных в табл.2 (примеры 1-4), концентрация люминола находится в интервале от 3 · 10-8 до 1 · 10-6 моль/дм 3. При запредельном повышении концентрации люминола понижается эффективность действия антиоксидантов, при запредельном понижении - повышается ошибка измерения интенсивности хемилюминесценции вследствие ее ослабления. В обоих случаях это приводит к снижению чувствительности определения антиоксидантов, т.е. к увеличению предела обнаружения (примеры 28-31). При заявляемой концентрации люминола максимальная чувствительность определения антиоксидантов достигается при концентрации пероксодисульфата в интервале от 2 · 10-3 до 1 · 10-2 моль /дм 3, гидроксида натрия - в интервале от 1 · 10-3 до 3 · 10-2 моль/дм 3 (табл.2, примеры 5-9) Верхняя граница интервала; концентраций пероксодисульфата определяется его растворимостью, нижняя - ослаблением хемилюминесценции, которое приводит к увеличению ошибки определения ее интенсивности, а следовательно, к увеличению предела обнаружения антиоксидантов (пример 5). При высоких концентрациях щелочи снижается эффективность действия антиоксидантов (пример 7). При концентрациях щелочи ниже, чем 1 · 10-3 моль/дм возникают трудности, связанные с регулированием величины рН, что усложняет методику определения антиоксидантов. Преимущества предлагаемого способа определения антиоксидантов отражены в табл.3, в которой приведены значения предела обнаружения органических соединений различных классов. Как следует из этих данных, чувствительность определения 4-фенилендиамина, пирокатехина, анилина и аскорбиновой кислоты намного выше, чем в известных способах. Предел обнаружения други х испытанных антиоксидантов также достаточно низкий (1 · 10-5-3 · 10 -10моль/дм 3). Следует отметить, что предлагаемый способ позволяет проводить определение антиоксидантов, которые невозможно определить известными способами, - этанола, изопропанола, бензола, ацетона и других. Предлагаемый способ более прост в исполнении, чем известные, - отпадает необходимость в определении максимального значения интенсивности хемилюминесценции, появляется возможность использования для определения антиоксидантов предварительно приготовленного раствора, содержащего все необходимые компоненты реакции.