Спосіб отримання вірусного інсектицидного препарату вірин мв

Спосіб отримання вірусного інсектицидного препарату, що включає використання діючої речовини - вірусу ядерного поліедрозу - та допоміжних компонентів, який відрізняється тим, що з насаджень аґрусу проводять збір гусениць 3-4-го віків аґрусового п'ядуна (Abraxas grossulariata L.), утримують їх без їжі в лабораторних умовах впродовж однієї доби, після чого впродовж 3,5-4,0 годин витримують при температурі 35±2 °С, розміщують в марлевих садках, утримують при температурі пові 3 ная композиция для защиты сельскохозяйственной продукции от насекомых. №5023182, МКИ A01N 63/00; С12 №7/00. НКИ 435-235.1. Заявка № 212641. Заявлено 28.06.88; Опубл. 11.06.91]. Згідно способу - прототипу, вірусна композиція для захисту насаджень від комах - сухий порошок, що складається з бакуловірусів, групи вірусів ядерного поліедрозу та вірусів гранульозу. Готується своєрідний субстрат, який вміщує в собі живильний компонент для личинок комах і виконує роль носія, інших компонентів, серед них визначальним є вміст в композиції дріжджів - джерела вітамінів. Живильне серидовище з яйцями чи личинками комах інкубують до початку інфекції личинок. Наступний елемент способу полягає у тому, що композицію гомогенізують у воді. Далі гомогенат висушують і отримують вірусну композицію. Недоліком відомого способу є те, що препарат, знаходиться у формі сухого порошка. Приготування його пов'язно з витратою часу, коштів. Висушування композиції супроводжується втратами патогенності діючої речовини та її ефективності. Багатокомпонентна композиція потребує ретельного підбору складових частин, серед яких такі її складові як личинки комах, що пов'язано з додатковими затратами на їх розведення та використання. В основу корисної моделі поставлено завдання отримати оригінальний вірусний ентомопатогенний препарат рідкої консистенції, для потреб захисту рослин, як складова частина інтегрованої технології захисту переважно ягідників та плодових насаджень. Поставлене корисною моделлю завдання досягається тим, що у способі отримання вірусного інсектицидного препарату Вірин MB, що включає використання діючої речовини - вірусу ядерного поліедрозу та допоміжних компонентів, згідно корисній моделі з насаджень аґрусу проводять збір гусениць 3...4-го віків аґрусового п'ядуна (Abraxas grossulariata L.), утримують їх без їжі в лабораторних умовах впродовж однієї доби, після чого впродовж 3,5...4,0 годин витримують за температури 35±2°С, і розташовують в марлеві садки та утримують за температури повітря 22±2°С та відносної вологості 75,0±5,0% і згодовують гусеницям листя аґрусу попередньо інфіковане природним штамом вірусу ядерного поліедрозу з титром 105 поліедрів/мл, а після масового зараження гусениць та їх загибелі, їх подрібнюють та розтирають в ступці, причому, на кожні 50мг біомаси додають по 0,5л води, фільтрують через марлю, розливають у пробірки, об'ємом 15-20мл, центрифугують 9-10 хвилин за 9тис. обертів/хвилину, відбирають вірусну суспензію і готують препарат Вірин MB у такому співвідношенні компонентів, мас, %: вірусна суспензія - 0,6...0,9; гліцерин -42,4...43,5; шлам 12,0...15,0; вода - решта. Для здійснення способу накопичують вірусну біомасу - діючу речовину препарату Вірин MB у гусеницях четвертого віку аґрусового п'ядуна (Abraxas grossulariata L.). Для цього, попередньо, проводять збір з насаджень аґрусу гусениць четвертого віку аґрусового п'ядуна, утримують їх без їжі в лабораторних умовах впродовж однієї доби. 33254 4 Інша суттєва відміна полягає у тому, що гусениць впродовж 3,5...4,0 годин витримують за температури 35±2°С. Далі, гусениць розташовують в марлеві садки за нормальних умов, за температури повітря 22±2°С та відносної вологості повітря 70,0±5,0% і згодовують гусеницям листя аґрусу, яке попередньо інфікують природним штамом вірусу ядерного поліедрозу з титром 105поліедрів/мл. Наступна суттєва відміна полягає у тому, що після масового зараження гусениць збудником і їх загибелі, трупи відбирали та готували для виділення з них вірусної суспензії. Суспензію із загиблих гусениць аґрусового п'ядуна готували шляхом ретельного подріблення та розтирання в ступці. Після цього, на кожні 50мг біомаси додавали по 0,5л води. Ретельно перемішували, фільтрували через потрійний шар марлі, розливали у пробірки об'ємом 15-20мл і центрифугували 9-10 хвилин за 9тис. обертів/хвилину. Наступна суттєва відміна передбачає отримання вірусного інсектицидного препарату Вірин MB, шляхом змішування окремих компонентів. Суть запропонованого способу полягає у тому, що внаслідок дії стресових факторів в природних популяціях аґрусового п'ядуна спорадичновиникають осередки спалахів вірозів, зокрема вірусу ядерного поліедрозу. В результаті візульного моніторингу, виявляли такі осередки, збирали інфікованих гусениць і отримували природний штам вірусу, яким заражали попередньо зібраних, здорових популяцій гусениць аґрусового п'ядуна. Внаслідок здійснення послідовних елементів способу, отримували вірусну біомасу - діючу речовину біологічного препарату. Запропонований препарат Вірин MB вміщує у собі, крім вірусної суспензії, наповнювач гліцерин, а також речовину - шлам, в якості протектанту, що захищає віруси ядерного полідрозу від інактивації їх ультрафіолетовими променями вірусну субстанцію препарату. Шлам - це відходи бологічної промисловості внаслідок виробництва кормових дріжджів та із деревної тирси. У складі запропонованого препарату шлам виконує роль речовини, що захищає діючу речовину препарату від сбнячної радіації. Отже, діюча речовина препарату Вірин MB природного походження - складова частина біоценозів. Інші складові компоненти цілком доступні, що спрощує технологічний процес виробництва препарату. Суттєвим є також те, що кінцевий продукт - препарат у вигляді рідини, не здійснюється процес сушіння, підчас якого відбувається основна втрата продукту та вірулентності. Приклад 1. Агроценоз аґрусу, з високим рівнем чисельності популяцій аґрусового п'ядуна. Моніторинг шкідника, візуальні спостереження, обліки чисельності, збір зразків гусениць п'ядуна різних видів. Дорощування в лабораторних умовах, виявлення гусениць заражених вірусом. Виділяли збудник, ідентифікували його. Діагностичні дослідження проводили за загально прийнятими методами та за прописами Гімза-Романовського та Швецової. Вірусну масу вирощували та накопичували в живих культурах гусениць аґрусового п'ядуна 3...4 5 33254 віків. Для цього проводили збір з насаджень аґрусу гусениць З...4 віків, розташовували в лаболаторії в марлеві садки за оптимальних умов. Далі, утримували їх без їжі впродовж однієї доби. Крім того, впродовж 3,5...4,0 годин витримували за температури 35±2°С. Стресовий фактор був тією причиною, яка призводила до масового зараження гусениць ядерним поліедрозом. Після того, як понад 25% гусениць п'ядуна загинули, у такому стані вони звисали на кущах вниз головою, зачепившись за гілки несправжніми ніжками, їх збирали та подрібнювали. Із гусениць, що загинули шляхом диференційованого центрифугування впродовж 9-10 хвилин, виділяли жир та пігменти. Далі готували препарат Вірин MB, у якому вірусна суспензія становила 0,6...0,9%; гліцерин 42,4...43,5%; шлам 12,0-13,0мас %, вода-решта. Приклад 2. Оцінка вірулентності. Визначали рівень вірулентності препарату Вірин MB відносно 6 гусениць аґрусового п'ядуна. Оцінку проводили з використанням фізіологічне здорових гусениць 3го віку п'ядуна. Було 3 варіанти, кожен з яких складався з 4-х повторностей по 30 гусениць у кожній. Визначали рівень вірулентності діючої речовини вірусу ядерного поліедрозу. Оцінювали цей тестовий показник на трьох варіантах. Вірус ядерного поліедрозу у складі препарту Вірин MB, зі всіма компонентами в оптимальних складах - перший варіант. Використовували тільки нативний штам вірусу аґрусового п^ядуна, без будь-яких компонентів - другий варіант. Нативний вірус ядерного поліедрозу у складі препарату, але без шламу третій варіант. Підсумкову ефективність визначали за показниками кількості гусениць п'ядуна, що загинули від поліедрозу. Результати досліджень наведено в таблиці 1. Таблиця 1 Рівень вірулентності інсектицидного препарату Вірин MBпо відношенню до гусениць аґрусового п'ядуна Варіанти Вірусний інсектицидний препарат Вірин MB (спосіб, що пропонується) Нативний вірус аґрусового п'ядуна Спосіб - найближчий аналог Кількість поліедрів 1,80´105 1,80´106 1,80´107 1,80´108 1,80´105 1,80´106 1,80´107 1,80´108 1,80´105 1,80´106 1,80´107 1,80´108 Встановлено, що різні концентрації віруса ядерного поліедрозу стали причиною різних показників рівня смертності гусениць шкідника. Цілком закономірно, що збільшення концентрації поліедрів, підвищувала кількість гусениць, що загинули. Спостерігається суттєва превага за цим показником препарату Вірин MB у заявлених параметрах. Очевидно, що максимальна вірулентність, отже ефективна дія вірусу ядерного поліедрозу, проявляється у складі препарату Вірин MB - перший варіант. Суттєво нижчим був цей показник у наступних двох варіантах. Загинуло гусениць п'ядунів від поліедрозу, % 42,6 50,3 75,8 91,2 40,3 48,6 70,2 84,6 41,2 46,3 69,7 80,2 Приклад 3. Обґрунтовували наступний елемент способу - вміст оптимальних параметрів поліедрів у вірусній композиці, а також інших компонентів - гліцерину та - шламу. Було передбачено три варіанти з вмістом поліедрів від 0,3 до 0,9мас.%. Відповідно був вміст інших компонентів у складі препарату. Підсумкову оцінку порівнювали із показниками способу -прототипу. Оцінку позитивного результату проводили згідно прийнятих критеріїв: летальної концентрації (ЛК50) та відрізку часу (ЛЧ50 та ЛЧ90), на протязі якого загинуло відповідно 50 та 90% популяцій гусениць аґрусового п'ядуна. 7 33254 8 Таблиця 2 Ентомопатогення активність вірусної композиції по відношенню до гусениць аґрусового п'ядуна в залежності від вмісту поліедрів та гліцерину Варіанти, що порівнюються Спосіб, що пропонується: вміст ВЯП - 0,7мас,%; гліцерин - 43,8 мас,%; шлам - 13,0 мас, %; вода - решта (оптимальні режими) Спосіб, що пропонується: вміст ВЯП - 0,9 мас, %; гліцерин - 43,5 мас,%; шлам - 15,0 мас, %; вода - решта (оптимальні режими) Спосіб, що пропонується: вміст ВЯП - 0,3 мас, %; гліцерин - 40,5 мас,%; шлам - 9,0 мас, %; вода - решта (за межами оптимальних режимів) Спосіб - найближчий аналог НІР05 ЛК50,% Довірчі інтервали, % ЛЧ50, дні Довірчі інтервали, Дні ЛК90 Ë× 90 0,05 0,02-0,04 6,5 5,8-9,0 8,9 1,36 0,03 0,02-0,04 6,2 5,2-8,8 9,1 1,46 0,15 0,09-0,18 11,4 10,1-18,4 26,8 2,35 0,18 0,10-0,23 18,2 2,6 12,1-21,6 4,5 39,2 2,7 2,15 Встановлено, що найбільш ефективна дія препарату спостерігалась, коли співвідношення компонентів у вірусній композиції становило, мас %: вірусна суспензія - 0,6...0,9; гліцерин 42,4...43,5; шлам - 12,0...15,0; вода - решта. Таким чином, запропонована для практики захисту насаджень ягідників, зокрема аґрусу, оригінальний біологічний препарат Вірин MB, з діючою Комп’ютерна верстка І.Скворцова Ë× 50 речовиною - вірусу ядерного поліедрозу, виділений з природних популяцій аґрусового п'ядуна. Обґрунтовані оптимальні параметри інших компонентів у складі препарату. Наведена характеристика вірулентності діючої речовини по відношенню до гусениць аґрусового п'ядуна, а також обґрунтована ентомопатогенна активність вірусної суспензії у складі препарату Вірин MB. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601