Спосіб отримання ентомопатогенного препарату

Спосіб отримання ентомопатогенного препарату, що передбачає введення в суспензію мікроспорідій, алкілфенілового ефіру поліетиленгліко 29221 розширити арсенал вітчизняних біологічних препаратів. Поставлене завдання досягається завдяки тому, що у запропонованому способі діюча речовина препарату спори мікроспорідій вирощувались в гусеницях дубового шовкопряду. Після досягнення гусеницями 5-го біологічного віку, їх подрібнювали, змішували з водою і після концентрації культуральної рідини, визначали концентрацію спор (КС) мікроспорідій, додавали поверхнево активні речовини - алкіл фенілові ефіри поліетиленгліколю (ОП-10) в кількості 3-6 мас.%, оцтову кислоту в кількості 2-6 мас.% - до встановлення у суспензії рН 4,0-5,0 та брильянтовий зелений в кількості 0,01-0,04 мас.%. інсектицидна активність встановлюється відомими методами, з допомогою тесткомах, імунохімічним методом, або на основі виміру кількісного вмісту спор мікроспорідій. За умов стандартного виробництва інсектицидна активність може бути встановлена опосередковано, наприклад, на основі вмісту спор в одиниці об'єму або маси. Введення поверхнево активних речовин типу ОП-10 дозволяє покращити товарні якості отриманого рідкого препарату, покращує прилипання краплин робочої рідини до листкової поверхні та змочування великої площі рослин за рахунок розтікання робочої суспензії. Додавання у композицію оцтової кислоти в кількості, що дозволяє встановити рН препарату на рівні 4,0-5,0 призводить до виключення розвитку сторонньої мікрофлори за будь-яких температурних умов, що є причиною тривалого збереження ентомоцидної активності препарату в умовах температур від -25 до +35°С. Введення брильянтового зеленого підсилює антимікробні властивості препарату, попереджує розвиток сторонньої мікрофлори, крім того, надає препарату зеленуватий колір, покращуючи тим самим товарний вигляд. При використанні високоефективних норм витрати - 2,0-3,0 кг/га, вноситься не більше 0,2-0,3 г брильянтового зеленого. Брильянтовий зелений використовується в сільському господарстві для захисту та збереження продуктів від псування, а також в медицині. Вміст оцтової кислоти також незначний. Якщо у рідкому препараті рН встановлюється 4,0 або 5,0, то в робочій рідині, приготованій на водопровідній воді, рН дорівнює 6,0. За умов слабкої буферності робочої рідини, ніяких змін кислотності в грунті або в рослинах не може відбуватись навіть якщо збільшити дозу в багато разів. Солі оцтової кислоти дуже швидко біодеградують, тому, що в низьких концентраціях вони стають для мікроорганізмів живильною речовиною. Таким чином, сукупність перерахованих ознак, запропонованого способу дозволяє отримати екологічно безпечний препарат з тривалим строком зберігання, зручний та ефективний при застосуванні проти комплексу лускокрилих шкідників саду та овочевих культур. Отже, запропонований ентомопатогенний препарат складається із таких компонентів: - спори мікроспорідії Vairimorpha antheraeae 0,015-0,-20; - алкіл феніловий ефір поліетиленгліколю - 3-6; - брильянтовий зелений - 0,01-0,04; - оцтова кислота - 2-6; - вода - решта або: - спори мікроспорідії Plistophora schubergi 0,003-0,015; - спори мікроспорідії Nosena antheraeae - 0,020,010; - алкілфеніловий ефір поліетиленгліколю - 3-6; - брильянтовий зеленки - 0,01-0,04; - оцтова кислота - 2-6; - вода - решта. Запропонований спосіб отримання ентомопатогенного препарату реалізується таким чином. Приклад 1. В результаті проведення целюлярного гренажу (вибраковка хворих популяцій дубового шовкопряду), хворих гусениць ретельно подрібнювали, готували суміш у водопровідній воді та центрифугували. В результаті була отримана культуральна рідина з вмістом спор мікроспорідій Vairimorpha, з титром 5,8´109 спор/мл. Після концентрування на сепараторі було отримано КС з титром 15,0´109 спор/мл. Далі, була встановлена вірулентність по відношенню до гусениць 3-го віку розанової листокрутки, яка складала 0,025%. З отриманої КС приготували 5 зразків препарату, що відрізнялись один від одного величиною рН. Початкова рН становила 7,0. За рахунок додавання оцтової кислоти в кількості 2-6 мас.%, було встановлено величину рН від 3,5 до 7,0. У всі зразки додавали 4% ОП-10. Підготовані таким чином зразки зберігали 3, 6 та 12 місяців при температурі +1012°С. Отримані результати представлені у табл. 1. З наведеного прикладу видно, щo титр препарату та вірулентність мають найбільш високі показники за величини рН 4,0-5,0, що відповідає вмісту оцтової кислоти в межах 3-6 мас.%. величини рН більш 7,0 та менше 3,5 встановлювати недоцільно з економічних міркувань. У вказаних параметрах, після року зберігання препарату, зберігається титр та вірулентність його і як видно з наведеного прикладу значно перевищує показники способупрототипу. Величина титру препарату, що пропонується, після року зберігання, перевищувала прототип у 1,5-2,0 рази. В цих межах знаходилась і величина вірулентності. Необхідність введення ОП10 визначається не тільки проблемою зберігання препарату, але і властивостями його під час застосування. Наявність ОП-10 в препараті при обробці рослин, особливо капусти, став вирішальним, сприяючи утриманню препарату на листках капусти досить тривалий час, які мають, як відомо, специфічний восковий наліт. Наводимо експериментальні матеріали, що обгрунтовують доцільність вмісту ОП-10 у препараті. Приклад 2. Із уражених мікроспорідіозом гусениць дубового шовкопряду, отримували культуральну рідину, з вмістом спор 5,8´109 спор/мл, як це описано у прикладі 1. У проби КС додавали ОП-10 у різній концентрації, від 1 до 20%, в ці зразки додавали також оцтову кислоту для збереження кислотності у межах 4,0-5,0. Аналогічним чином зберігали зразки препаратів на протязі 3, 6 та 12 місяців, в умовах, як це описано у прикладі 1. Результати, що отримали після закінчення терміну зберігання наведені у табл. 2. Наведені результати підтверджують, що препарат, де діючою речовиною є мікроспорідія Vairi 2 29221 morpha, отримані найкращі показники продуктивності - титр спор та вірулентність знаходяться за умов, коли концентрація ОП-10 у зразках препаратів знаходиться в межах 5-15%. Встановлено значне перевищення цих показників після 12-ти місячного терміну зберігання препарату в порівняні зі способом-прототипом за всіма тестовими показниками. Приклад 3. Iз КС отриманих згідно умов описаних у прикладі 1, готували суміш спор Plistophora та Nosema у рівних пропорціях. Підготували 5 зразків препаратів з рівним вмістом у них брильянтового зеленого, показник рH був оптимальним, в межах 4,0. Вміст ОП-10 становив 10%. В табл. 3 наведені результати продуктивності (титр спор та вірулентність) препаратів, в залежності від терміну їх зберігання. Встановлено, що найкращі показники продуктивності зразків препарату відповідають концентрації брильянтового зеленого в межах 0,01-0,04%. Після 12 місяців зберігання, продуктивність препарату, що пропонується суттєво перевищувала продуктивність прототипу (табл. 3). Отже, за оптимальних значень рН та вмісту ОП-10, брильянтовий зелений, у концентрації 0,01-0,04% створював кращі умови для збереження титру препарату та його вірулентності, за умов, коли діючою речовиною була суміш спор Plistophora та Nоsеmа в рівних пропорціях. Приклад 4. Отримані iз уражених гусениць дубового шовкопряду спори мікроспорідій, як це описано у прикладі 1, доводили концентруванням титру до необхідної величини, додавали інші, необхідні компоненти. Готували пo 15 зразків кожного із 4-х препаратів, а також прототипу. Всі зразки спеціально інфікувались після приготування виробничими промивками, що мали велику кількість різноманітної сторонньої мікрофлори. Компонували 2 зразки запропонованих ентомопатогенних препаратів з оптимальним вмістом компонентів. Склад препаратів наведений у табл. 4. Варіанти 1 і 2 відповідають препарату, що пропонується. Варіанти 3 та 4 мають тіж компоненти, за виключенням брильянтового зеленого. Зразки запропонованих препаратів, а також препарат, отриманий за способом-прототипом, зберігали при температурі +1012°С. Перед збереженням, встановлювали їх токсикологічні властивості згідно стандартних методів, з використанням гусениць розанової листокрутки 3-го віку. Результати досліджень наведені у табл. 4. Встановлено, що після 12 місяців зберігання препарати, що пропонуються (вар. 1 та 2) зберігали високі, у 0,7-1,5 рази вищі ніж у прототипу, показники титру та вірулентності. Крім того, присутність у зразках препаратів такого компоненту, як брильянтовий зелений, виключає можливість розвитку сторонньої мікрофлори. У зразках (вар. 3 та 4), які не мали брильянтового зеленого, а також у прототипі, зразки були засмічені сторонньою мікрофлорою, що виявили результати мікроскопічного аналізу, а також про це свідчив різкий, неприємний запах цих зразків, що свідчить про втрату якості препаратів. Приклад 5. Отримані таким способом ентомопатогенні препарати, що вміщували в собі оптимальну кількість компонентів, застосовувались для обмеження чисельності та шкодочинності компле ксу садових листокруток: сітчастої, смородинової та розанової. Обприскування проводили у фенофазу кінця цвітіння яблуні, коли переважали гусениці листокруток молодших віків. Саме в цей період хімічні засоби використовувати недоцільно у зв'язку з масовою активністю природних популяцій ентомофагів та бджіл. Витрата препарату становила 3 л/га. Отримані результати наведені у табл. 5. Біологічна ефективність препаратів, що пропонуються, становила 81,9-83,8%, що повністю забезпечило захист саду від цієї групи шкідників. Досягнуто суттєве збільшення ефективності у порівнянні з прототипом за всіма показниками. Якщо у контролі величина ефективної частини популяції залишалась практично на одному рівні, то внаслідок обробок препаратами, що пропонуються, вона склала всього 14,9-16,6, в прототипі 31,7%, що є важливим екологічним наслідком застосування препаратів запропонованих у способі. Приклад 6. Отримані таким чином ентомопатогенні препарати, що вміщували оптимальну кількість компонентів, використовували в технології вирощування капусти, пізнього строку визрівання, сорт Лангендейкер. Препарати використовували проти гусениць капустяної совки, одного з небезпечних шкідників капусти. Популяція совки характеризувалась як така, що була у фазі наростання чисельності та масового розмноження і мала високий рівень життєздатності. Це ілюструють матеріали трирічних (1994-1996 pp.) досліджень у табл. 6. Використання запропонованих ентомопатогенних препаратів (варіант 1 та 2), показало високий рівень ефективності. Досягнутий технічний результат полягає у статистично вірогідному збільшенні рівня біологічної ефективності на 12,514,4%, валового урожаю на 88-93 ц/га, а також у зниженні ушкодженності рослин у порівнянні з використанням препарату, отриманого згідно способу-прототипу. Підсумковий технічний результат був на рівні використання високотоксичного хімічного препарату децису - хімічного еталону, що повсюдно використовується у технологіях вирощування. Біологічний аспект використання препаратів полягає у тому, що запропоновані препарати у способі не шкідливі для людей, теплокровних тварин та корисних видів комах. Отримані результати важливі в практичному відношенні, зважаючи на те, що популяції капустяної совки традиційно стійкі до дії бактеріальних препаратів. Таким чином, запропоновані ентомопатогенні препарати на основі мікроспорідій характеризуються високим рівнем технологічності, а також високоефективні при використанні в агроценозі плодового саду та насаджень капусти. Діюча речовина препаратів - спори мікроспорідій отримують як відходи внаслідок вигодівлі дубового шовкопряду. Решта компонентів - сполуки, що виготовляються в Україні. Отже, виготовлення та використання препаратів цілком сприйнятливо та доцільно. Джерела інформації 1. Исси И.В. Применение микроспоридий для биологической борьбы с насекомыми, вредящими сельскому хозяйству. В кн.: Биологические средства защиты растений. М. Колос., 1974, с. 350-373. 3 29221 2. Елфимова Т.В. Оптимальные условия массового получения спор двух микроспоридий в капустной совке. Автореф. дис. канд. диол. наук АН Казахской ССР. Алма-Ата, 1985, 16 с. 3. Авторское свидетельство СССР "Средство борьбы с чешуекрылыми вредителями". Четкаро ва Е.Н., Дрозда В.Ф. и др. № 853847, 1981, МКИ А01N63/00. 4. Патент України № 20277 "Спосіб отримання ентомопатогенного препарату". Дрозда В.Ф. та ін. 1997, МКВ А01N63/00 (прототип). Таблиця 1 Показники вірулентності та величини титри спор у 5-ти зразків препарату в порівнянні з прототипом, в залежності від величини рН. Мікроспоридії Vairimorpha antheraeae Величина РН зразків, внаслідок введення оцтової кислоти 7,0 5,0 4,5 4,0 3,5 Тест-показники, згідно способупрототипу Після 3-х місяців зберігання Після 6-х місяців зберігання Після 12-х місяців зберігання Початковий титр, ´109 спор/мл Початковий показник ЛК50, % Титр, ´109 спор/мл ЛК50, % Титр, ´109 спор/мл ЛК50, % Титр, ´109 спор/мл ЛК50, % 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 8,1 10,1 11,2 9,7 7,8 0,14 0,07 0,06 0,09 0,13 7,2 8,8 8,7 9,1 7,5 0,16 0,11 0,10 0,09 0,28 4,9 7,5 7,0 6,8 5,2 0,26 0,18 0,22 0,30 0,38 15,0 0,05 7,7 0,12 7,1 0,32 4,8 0,42 Таблиця 2 Показники вірулентності та величини титри спор мікроспорідії Vairimorpha antheraeae у 5-ти зразків препарату, що пропонується в порівнянні з прототипом, в залежності від вмісту в них ОП-10 Кількість ОП-10 у препараті, % 1,0 5,0 10,5 15,0 20,5 Тест-показники, згідно способупрототипу Початковий титр, ´109 спор/мл 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Початковий показник ЛК50, % 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 Після 3-х місяців зберігання Титр, ЛК50, % ´109 спор/мл 8,9 0,15 11,8 0,08 10,9 0,09 11,0 0,10 9,2 0,14 9,3 0,13 4 Після 6-х місяців зберігання Титр, ЛК50, % ´109 спор/мл 6,8 0,16 8,9 0,14 9,2 0,12 10,1 0,10 7,1 0,18 8,0 0,30 Після 12-х місяців зберігання Титр, ЛК50, % ´109 спор/мл 6,2 0,31 7,3 0,24 8,1 0,23 9,0 0,17 5,6 0,32 6,7 0,34 29221 Таблиця 3 Показники продуктивності 5-ти зразків препарату, що пропонується в порівнянні з прототипом. Суміш мікроспоріді Кількість брильянтового зеленого, % 0,1 0,01 0,02 0,04 0,06 Тест-показники, згідно способупрототипу Початковий титр, х109 спор/мл Початковий показник ЛК30, % 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 15,0 0,06 Після 3-х місяців, зберігання Титр, х109 ЛК30, % спор/мл 11,1 0,10 14,5 0,04 15,0 0,06 13,9 0,02 10,8 0,08 12,4 0,13 Після 6-х місяців, зберігання Титр, х109 ЛК30, % спор/мл 11,2 0,12 12,3 0,09 13,5 0,11 10,9 0,10 8,6 0,14 10,1 Після 12-х місяців, зберігання Титр, х109 ЛК30, % спор/мл 8,5 0,38 8,9 0,17 9,2 0,13 10,1 0,15 7,9 0,21 0,16 6,2 0,26 Таблиця 4 Показники продуктивності 5-ти зразків препарату, що пропонується в залежності від складу компонентів у ньому та термін зберігання № п/п 1 2 3 4 5 Складові частини компонентів ентомопатогенного препарату Після 12-х місяців зберігання Зразків з сторонньою мікрофлорою, через 12 місяців Початковий титр, ´109 спор/мл Початковий показник ЛК50, % Титр, ´109 спор/мл ЛК50, % 15,0 0,05 10,2 0,16 відсутні 15,0 0,05 9,8 0,14 відсутні 15,0 0,05 7,3 0,26 4 15,0 0,05 6,2 0,32 3 15,0 0,08 5,8 0,36 8 Спори Рlistophora -0,003%; спори Nosema - 0,010%; рН - 5,0; брильянтовий зелений - 0,01; ОП-10 - 5% Спори Vairimorpha 0,015%; рН - 5,0, брильянтовий зелений - 0,01; ОП10 - 5% Спори Plistophora -0,015%; спори Nosema - 0,020%; рН - 4,0; ОП-10 - 5% Спори Vairimorpha - 0,020% рН - 4,0; ОП-10 - 5% Препарат, отриманий згідно способу-прототипу Таблиця 5 Ефективність запропонованих ентомопатогенних препаратів для обмеження шкодочинності садових листокруток, ВАТ “Березанське” (1994-1996 pp.) Препарати, що використовуються Препарат, що пропонується: спори Peistophora 107 спор/мл, спори Nosema 107 спор/мл, брильянтовий зелений - 0,04%, оцтова кислота - 2%, ОП-10 - 3% Препарат, що пропонується: спори Vairimorpha 107 спор/мл, брильянтовий зелений 0,04%, оцтова кислота – 2%, ОП-10 – 3% Препарат, отриманий згідно прототипу Контроль (без обробки) Чисельність гусениць на 100 гілок Біологічна ефективність, % Пошкоджено рослин, % Величина ефективної частики популяції, % 11,4±1,3 83,8 3,1 14,9 10,2±0,9 81,9 2,9 16,6 10,7±0,8 12,0±1,5 65,4 12,8 39,2 31,7 91,6 5 29221 Таблиця 6 Порівняльна ефективність препаратів, що пропонуються в порівнянні з ефективністю відомого препарату. Шкідливий вид - капустяна совка на насадженнях капусти, ВАТ “Березанське” (1994-1996 pp.) Препарати, що використовувались Препарат, що пропонується: спори Peistophora 107 спор/мл, спори Nosema 107 спор/мл, брильянтовий зелений - 0,04%, оцтова кислота - 2%, ОП-10 - 3% Препарат, що пропонується: спори Vairimorpha 107 спор/мл, брильянтовий зелений - 0,04%, оцтова кислота - 2%, ОП-10 - 3% Препарат відповідно з прототипу Децис 2,5% к.е., 0,3 л/га (еталон) Контроль (без обробки) НСР0,5 Характеристика популяції капустяної совки ГусеЯєць у ЗасеМаса Плодюниць, одній лено лялечість, екз. на кладці, рослин чок, мг екз. 20 росекз. % лин Біологічна ефективність, % Пошкоджено рослин, % Урожай ц/га 466 1388 268 68 39 87,4 3,8 624 503 1412 253 73 41 88,3 2,9 619 492 1476 262 82 50 73,9 12,8 531 512 1503 279 71 48 83,0 2,8 622 479 1302 252 59 39 78,8 269 8,7 6,8 20,9 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 6