Спосіб отримання вірусного інсектициду

Спосіб отримання вірусного інсектициду, що включає приготування живильного середовищі, де вирощують вірус ядерного поліедрозу, його інкубують, гомогенізують у воді і відрізняється тим, що інкубацію проводять у гусеницях 3-4-го віків дубового шовкопряду Antheraeae pernyi G.-M. (Lepidoptera, Saturnidae). (19) (21) 98052768 (22) 28.05.1998 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Дрозда Валентин Федорович (73) ІНСТИТУТ ЗАХИСТУ РОСЛИН УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ Н АУК 30554 Відомий також спосіб отримання вірусної інсектицидної суміші, де як патоген використовують вірус ядерного поліедрозу тутового шовкопряду [5]. Цей спосіб функціонально є найбільш близьким технічним рішенням, до способу, що пропонується і вибраний нами як прототип. Формально прототип заявлено як "Спосіб боротьби". Однак, по суті винаходу, його функціонального призначення, в основі є елементи, характерні для "Способу отримання препарату", тобто, наявність сумісних суттєви х ознак прототипу та способу, що пропонується. Згідно прототипу, як патоген на вірусній основі, проти лучного метелика, його гусениць, використовують вірус ядерного поліедрозу туто вого шовкопряду. Для цього, використовують водну суспензію, що містить 9,8´105 поліедрів/мл, далі її наносили на листки полину гіркого, який згодовували гусені лучного метелика 1-го віку. Після поїдання гусеницями зараженої їжі, їх годували свіжими листками полину. Внаслідок цього, через 5-10 днів гинуло 81,5% гусениць метелика. Згідно прототипу, для обробки 1 га посівів, необхідно витрачати 100-150 літрів вірусного препарату, що вміщує у собі 1´106 - 7´107 поліедрів в 1 мл. Проте, відомий спосіб має такі недоліки: 1. Неймовірно високі норми витрати вірусного препарату на 1 га, згідно прототипу, це 100150 л. Загальноприйнято, що максимальні норми витрати не перевищують 1,5-3 л/га. 2. Для такої кількості препарату необхідна величезна кількість вихідного матеріалу - гусениць тутового шовкопряду, їх вирощування пов'язане зі значними матеріальними та енергетичними витратами. 3. Гусениці тутового шовкопряду - джерело поліедрів вірусу, живляться лише листям шовковиці. Це досить рідкісна рослина і для її вирощування необхідні особливі вимоги агротехніки, догляду. 4. Лучний метелик відзначається надзвичайною шкодочинністю. Згідно прототипу загибель личинок настає на 5-10 день. До цього часу, гусениці метелика спричиняють значну шкоду рослинам. 5. В прототипі дія вірусного препарату ні з чим не порівнюється, ні з хімічними, ні з біологічними препаратами, тому важко об'єктивно оцінити ефективність вірусного препарату. 6. При вирощуванні гусениць тутового шо вкопряду, дотримуються суворих профілактичних заходів, що виключає спонтанні прояви масових інфекцій, їх можна створити шля хом дії стресового фактору. Проте, в матеріалах прототипу про це не повідомляється. 7. Вузький спектр дії препарату, лише на один вид шкідника. В основу винаходу поставлено завдання отримати рідкий ентомопатогенний вірусний інсектицидний препарат з тривалим строком зберігання без втрати ентомоцидної активності, екологічно безпечного, з мінімальними витратами матеріальних засобів та коштів, ефективного проти шкідливих комах. Як відомо, віруси не можуть вирощуватись на штучни х живильних середовищах. Отже, для масового їх вирощування, у тому числі для потреб боротьби з шкідниками сільськогосподарських культур, в лабораторних умовах в спеціальних інсектаріях вирощуються комахи-хазяї, на личинках яких вирощуються культури вірусів. У запропонованому способі, діючу речовину вірусного інсектициду - вірус ядерного поліедрозу, вирощували у гусеницях дубового шовкопряду. Основне призначення дубового шовкопряду – отримання натуральної шовкової сировини – чесучі, з якої виготовляють одяг. Використовується шовкова сировина також для інших цілей, як ізоляційний матеріал, а також для медичних потреб. У запропонованому способі пропонується використовувати дубовий шовкопряд (гусениці 3-4-го віків) для вирощування та накопичення вірусу ядерного поліедрозу - діючої речовини вірусного інсектициду. Суть способу полягає в тому, що в якості живильного середовища, де вирощувалась діюча речовина вірусного інсектициду - вірус ядерного поліедрозу (ВЯП), використовувались гусениці дубового шовкопряду Antheraeae pernyi G.-M. (Lepidoptera, Saturnidae) 3-4-го віків. Після досягнення гусеницями дубового шовкопряду 3-4-го віків і накопичення у них вірусу ядерного поліедрозу, гусениць ретельно подрібнювали, тобто гомогенізували, у воді. При цьому титр поліедрів становив 6´107 - 1´109. Головна перевага способу, що пропонується, у тому, що те хнологічно дубовий шовкопряд вирощувати не складно, Частину гусениць від основної партії, що вирощуються для отримання чесучі, можна відбирати для вирощування у них і приготування вірусу ядерного поліедрозу. Гусениці шовкопряду можуть успішно вирощува тись поза межами приміщення, на волі у інсектаріях, обгорнутих плівками з поліетилену, або на зразок рибальських сіток. Живляться вони листям малоцінних видів дерев: граба, бук у, берези, верби. Перевага рідкої форми препарату - низька собівартість, внаслідок того, що не використовується процес сушіння, коли відбувається основна витрата продукту. Відсутність шкідливого пилу під час приготування робочих розчинів має гігієнічне значення. Суттєва перевага перед сухими порошками в період нанесення робочих суспензій на рослини ідеальні умови покриття рослин. Таким чином, запропонований ентомопатогенний препарат вміщує у собі такі співвідношення компонентів, мас, %: 1. Вірусна суспензія 0,4-0,7. 2. Вода - решта. Кількість поліедрів не менше 1´108 млрд/мл. Препарат токсини виробляти не здатний. Фізична характеристика - рідинна суспензія поліедрів у воді. Приклади здійснення способу Культура дубового шовкопряду породи Поліський тасар, гусениць якої вигодовували на листі берези в кількості 500 шт. Вигодівля шовкопряду відбувалась за загальноприйнятими методами. З ентомопатогенних об'єктів використовували нативні віруси, які виділяли з популяцій дубового шовкопряду, а також капустяної совки. Останні вирощувались для токсикологічної оцінки запропонованого вірусного інсектициду. Вірус ядерного поліедрозу (ВЯП) дубового шовкопряду було отримано шляхом активації ла 2 30554 тентного вірусу в умовах лабораторії. Для цього, гусениць піддавали дії стресового фактору – гусениці голодували протягом 72 годин, а також піддавали їх дії підви щеної температури (38-42°С) на протязі 4-х годин. Отриманий таким чином збудник вірусної інфекції був виділений та розмножений для оцінки його вірулентності. Діагностичні дослідження проводили за допомогою світлового мікроскопу МБИ-6. Для діагностики вірусів в світловому мікроскопі, в окремих випадках, застосовували методи пофарбування Гимза-Романовського та Шевцової, за наявності гранул фарбували за методом Мона. Накопичення ВЯП. Віруси накопичували на гусеницях дубового шовкопряду III-IV віків. Для цього готували водний розчин вірусного препарату з титром поліедрів 6´107 - 1´109 і ретельно перемішували. Далі, за допомогою пульверизатора, ним ретельно обприскували букети з гілок берези, які були їжею для гусениць шовкопряду. Гусениць, що загинули від вірусу гранульозу, зберігали в морозильній камері холодильника при температурі -7°С. Виділення вірусів з біоматеріалу, що зберігався в морозильній камері, його очищення та концентрацію проводили згідно загальноприйнятих методів. Розморожену біомасу розтирали в ступці у невеликій кількості води, далі отриману масу ретельно розводили водою і фільтрували через 3-4 шари марлі. Виділення та очищення ВЯП дубового шовкопряду із щойно загиблих гусениць проводили таким чином: фільтрат, отриманий після грубої очистки суспензії, центрифугували 20 хвилин для видалення жиру та пігментів. Далі, готували вірусний інсектицид, у якому, вірусна суспензія становила 0,4-0,7 мас.%, решта вода. Оцінка вірулентності Приклад 1. Визначали рівень вірулентності запропонованого інсектициду відносно гусениць шкідливих комах. Оцінку проводили з використанням гусениць 3-го віку капустяної совки. Було три варіанти, кожен з яких складався з чотирьох повторностей, по 30 гусениць в кожній. Визначали рівень вірулентності інсектициду, отриманого з дубового шовкопряду, нативного вірусу з капустяної совки та штам чужого вірусу, що пройшов пасаж через гусениць совки. Результати досліджень наведені у табл. 1. Як видно, дія вірусного інсектициду, отриманого з гусениць дубового шовкопряду не тільки не поступалася дії нативного вірусу совки, але й перевищувала її. Особливо вираженою була дія інсектициду, отриманого з шовкопряду після попереднього пасажу через гусениць совки. При титрі 1,45´106 - 1,45´108, загинуло 74,9-95,8% гусениць совки. Отже, встановлено, що віруси поліедрозу можуть адаптуватись до інших комах і це явище супроводжується підвищеного сприйнятливістю хазяїна до невластивого їм збудника хвороби. Приклад 2. Наступний елемент способу, обгрунтування оптимальних параметрів вмісту поліедрів вірусу у препараті. Було передбачено 4 варіанти з різним вмістом ВЯП, від 0,3 до 0,9%. Результати досліджень наведено утабл. 2. Оцінку проводили згідно прийнятих критеріїв: летальної концентрації та відрізку часу, на протязі якого загинуло 50% популяції капустяної совки. Встановлено, що найбільш ефективна дія препаратів спостерігалась коли співвідношення компонентів становило, %: 1. Вірусна суспензія - 0,4-0,7. 2. Вода - решта. Приклад 3. Польові дослідження оцінки ефективності вірусного інсектициду, що пропонується, проводили впродовж трьох років (1994-1996 pp.) у ВАТ "Березанське" Київської області на полі капусти пізнього строку визрівання - Харківська зимова. Площа кожного варіанту становила 1 га, контроль 0,001 га. Препарати використовували проти гусениць капустяної совки молодших віків 2-го покоління, численність яких перевищувала порогову. Вірусний інсектицид, що застосовували у дво х варіантах, з нормою витрати на 150 та 200 мл на 1 га. Його дію порівнювали з дією препарату, отриманого згідно прототипу, та з рекомендованими в галузі хімічними та біологічними інсектицидами, які використовувались як господарський еталон. Результати досліджень наведено у табл. 3. Як видно, за показниками біологічної та технічної ефективності вірусний препарат переважав не тільки показники прототипу, а і біологічний еталон і не поступався хімічному еталону. Отримані результати свідчать про значний позитивний результат, що отримано в результаті використання вірусного препарату, та доцільність його використання як з господарських так і екологічних міркувань. Приклад 4. Популяція яблуневої плодожерки, що впрошувалась на штучному живильному середовищі. Проводилась оцінка вірулентності інсектицидного препарату, що пропонується, по відношенню до гусениць яблуневої плодожерки (табл. 4). Встановлено, високий рівень вірусного інсектициду і крім того адаптацію вірусу ядерного поліедрозу отриманого з дубового шовкопряду до нового хазяїна - яблуневої плодожерки, супроводиться високим рівнем загибелі плодожерки в межах титрів, що використовувались. Таким чином, запропонований вірусний інсектицид проявляє токсичні властивості відносно популяцій гусениць таких небезпечних шкідників сільськогосподарських культур як капустяна совка та яблунева плодожерка. Хазяїн, на якому вирощується вірус ядерного поліедрозу, - діюча речовина інсектициду, гусениці 3-4-го віків дубового шовкопряду, технологія вирощування якого налагоджена. Існує порода шовкопряду Поліський тасар, виведена в Україні і може бути використана, як це показано у запропонованому способі, для отримання вірусного інсектициду. Джерела інформації 1. Биологические средства защиты растений. М., Колос, 1974, с. 335-345. 2. Воробьева Н.Н. Энтомопатогенные вирусы. Наука, Сибирское отделение. Новосибирск, 1976, 286 с. 3. Патент США. "Состав вирусны х инсектицидов", № 4716039, А01 № 63/00; НКИ 424-93, Заявка: 734889; Опубл. 29.12.1987. 4. Патент США. "Состав композиции для защиты сельскохозяйственной продукции от насеко 3 30554 мых" № 5023182, С12 № 7/00; НКИ 435-235, Заявка: 212641; Опубл. 11.06.1991. 5. Карпов А.Е., Омелюта В.П. Способ борьбы с луговым мотыльком. Авторское свидетельство СССР № 974638; А01 01.09.1978 (прототип). № 63/00; Заявлено: Таблиця 1 Оцінка вірулентності вірусного інсектициду відносно гусениць капустяної совки. Гусениць 3-го віку вигодовували листям, обробленим препаратами Варіант Вірусний інсектицид (спосіб, що пропонується) Нативний вірус капустяної совки Після одного пасажу чужого вірусу через гусениць совки Кількість поліедрів в 1 мл 1,45´105 1,45´106 1,45´107 1,45´108 1,45´105 1,45´106 1,45´107 1,45´108 1,45´105 1,45´106 1,45´107 1,45´108 Загинуло від поліедрозу, % 38,7 40,9 66,4 82,6 34,9 38,5 59,7 77,4 62,5 74,9 89,9 95,8 Таблиця 2 Ентомопатогенна активність зразків препаратів в залежності від вмісту поліедрів вірусу та наповнювача. Об'єкт - капустяна совка Варіант препаратів Інсектицид, що пропонується, вміст – ВЯП - 0,3% вода - решта Інсектицид, що пропонується, вміст – ВЯП - 0,4% вода - решта (оптимальні режими) Інсектицид, що пропонується, вміст – ВЯП - 0,7% вода – решта (оптимальні режими) Інсектицид, що пропонується, вміст – ВЯП - 0,9% вода - решта Прототип ЛЧ50 дні 15,4 Довірчі інтервали дні 12,2-18,5 ЛЧ90/ЛЧ50 0,10 Довірчі інтервали % 0,07-0,13 0,03 0,01-0,06 9,4 6,8-12,0 1,34 0,02 0,01-0,03 8,2 7,0-9,4 1,23 0,09 0,07-0,11 13,6 9,8-17,4 2,88 0,16 0,09-0,23 17,8 14,3-21,2 4,16 ЛК50 % 4 3,12 30554 Таблиця 3 Порівняльна ефективність використання вірусного інсектициду, отриманого згідно запропонованого способу при використанні його в боротьбі з капустяною совкою (ВАТ "Березанське", 1994-1996 pp.) Витрата препарату, кг/га Варіант, що порівнюється Гусениць совки до обробки, екз/40 рослин Загинуло на 10-й день, екз Біологічна ефективність % Пошкоджено рослин % Урожай ц/га 0,150 28,4 22,8 78,6 4,5 411,5 0,200 32,6 28,1 85,0 3,6 420,5 2,0 30,9 22,2 69,4 16,9 388,6 20,0 26,5 15,7 55,7 26,5 329,2 0,3 30,4 27,2 88,6 2,9 426,6 27,3 2,2 48,8 238,8 Вірусний інсектицид (препарат, що пропонується) Вірусний інсектицид (препарат, що пропонується) Лепідоцид к.п. (біологічний еталон) Прототип Децис 2,5% к.е. (хі0мічний еталон) Контроль (без обробки) Таблиця 4 Оцінка вірулентності вірусного інсектициду відносно гусениць яблуневої плодожерки Варіант Вірусний інсектицид (спосіб, що пропонується) Нативний вірус яблуневої плодожерки Після одного пасажу чужого вірусу через гусениць плодожерки Кількість поліедрів в 1 мл 1,45´105 1,45´106 1,45´107 1,45´108 1,45´105 1,45´106 1,45´107 1,45´108 1,45´105 1,45´106 1,45´107 1,45´108 Загинуло від поліедрозу, % 40,6 44,8 68,2 76,5 38,5 42,4 53,8 69,7 69,2 77,4 88,5 92,2 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5