Спосіб визначення антиендотеліальних антитіл

Спосіб визначення антиендотеліальних антитіл, що полягає в одержанні сироватки стандартним способом, виготовленні антигену шляхом водно-сольової екстракції компонентів арте ріальної стінки, стандартизуванні антигена за вмістом білку, проведенні реакції антиген-антитіло з використанням отриманих сироваток та антигену, реєстрації реакції антиген-антитіло за допомогою стандартних імунологічних методів який відрізняється тим, що, в якості антигену використовують ендотеліальний шар артеріальної стінки, який відокремлюють від інших компонентів судинної стінки шляхом короткочасного лритулення ендотеліальної поверхні до льоду з фосфатного буфера, охолодженого до -10-12 в С з наступним відриванням непримерзлих компонентів судинної стінки від примерзлого ендотелію. Винахід стосується медицини, а саме ла- * бораторноі діагностики, і може бути використаний для визначення антиендотеліальних антитіл у хворих з захворюваннями внутрішніх органів. Наявність антиендотеліальних антитіл в крові є важливим чинником розвитку різноманітних захворювань внутрішніх органів, який пов'язаний не тільки з первинним ураженням ендотелію судин, а й появою антиендотеліальних антитіл в процесі формування патогенетичних ланок значного кола захворювань людини. З одного боку судинний ендотелій приймає участь в регуляції імунних реакцій, безпосередньо забезпечуючи процеси адгезії, проникнення та видалення імунокомпетентних клітин, несе на собі досить значний рецепторний апарат для імуноглобулинів. складових частин системи комплементу, з іншого • може сам ставати об'єктом, проти якого спрямовуються імунні реакції. Модифікація структурного та (або) функціонального стану ендотелію різноманітними патологічними чинниками, яка приводить до змін його антигенного складу, відіграє велику роль в ініціюванні та самопідтриманні патологічних аутоімуних процесів. Відомий спосіб визначення антиендотеліальних антитіл, що полягає у наступному: 1. Одержують сироватки досліджуваних людей стандартним способом. 2. Проводять адсорбцію сироваток на клітинах лінії А549 3. Клітини ендотеліальної гибридомної клітинної лінії ЕАпу 926 розсівають у лунки 96-ямко вого плоскодонного планшета в концентрації 2*10 4 клітин на лунку. 4. Культивують отримані клітинні культури 2-3 дня для досягнення монослоем конфлюєнтності. 5. Фіксують клітини 0 , 1 % розчином глютаральдегіду 10 хвилин при 4° С (100 мкл/лунку). 6. Триразово відмивають фіксований монослой клітин у фосфатно-сольовому буфері з 1 % бичачим сироватковим альбуміном і 5 мМ ЭДТА. 7. Инкубують відмиті монослої клітин 2 години'при 37°С и 100% вологості з 3% розчином бичачого сироваткового альбуміну у фосфатно-сольовому буфері (200 мкл на лунку). 8 Промивають лунки планшета 2 рази. 9. Инкубують 2 години при 37"С та 100% вологості з 100 мкл досліджуваних сироваток, розведених фосфатно-сольовим буфером. 10. Промивають лунки планшета 4 рази., 11. Инкубують 1 годину при 37*С та 100% вологості з 100 мкл відповідних розведень специфічних - до имуноглобулинів людини, імунних сироваток, мічених пероксидазою. 12. Промивають лунки планшета 4 рази. 13. Вносять у лунки планшета 50 мкл субстрату (ортофенилендіамин у концентрації 0,5 мг%/мл і 0,01% перекис водню в 10-1 натрій-цитратному буфері при рН 5,0). 14. Зупиняють реакцію за допомогою 25 мкл 10% розчину сірчаної кислоти. 15. Вимірюють оптичну густину змісту лунок фотометрично. 00 ю со О) 35184 16 Антиендотеліальні антитіла визначають за формулою 100*(О-Н)/(П-Н), де О - оптична густота досліджуваного зразка, Н - оптична густота стандартного негативного контролю, П - оптична густота стандартного позитивного контролю (Саложин В К , Щербаков А Б, Насонов Е Л и др Антиэндотелиальные антитела при системной склеродермии и болезни Рейно // Терапевтический архив -1995 - № 5 -С 54-57 ) Суттєвими ознаками аналогу і винаходу, що збігаються, є такі 1 Проведення лабораторного дослідження 2 Отримання сироватки стандартним способом Однак при використанні цього способу визначаються не антиендотеліальні антитіла, а антитіла до клітин гибридомної лінії, що використовуються для фіксації циркулюючих у крові антитіл Хоча ендотеліальна природа цієї клітинної лінії підтверджується присутністю внутрішньоклітинного антигену фактора Вілебранда, спроможністю їх продукувати тромбомодулин, протеїн S і тканинний активатор плазміногену, не виключена модифікація антигенного складу клітин у процесі одержання гибридоми і наступного культивування У результаті цього, визначення антиендотеліальних антитіл, що фіксуються на клітинах гибридомної лінії, може приводити до того, що їхній рівень може штучно занижуватись у випадку, коли в досліджуваній сироватці превалюють антитіла до тих антигенних детермінант, що були втрачені та (або) модифіковані на клітинах гибридомної лінії, що значно знижує точність і достовірність результатів дослідження Значна КІЛЬКІСТЬ проміжних етапів, що необхідно провести при проведение визначення антиендотеліальних антитіл зазначеним способом, суттєво знижує, відтворюванність результатів дослідження, тому що кінцевий результат значною мірою залежить від старанності дотримання процедури здійснення всіх проміжних етапів і найменше відхилення від умов проведення значною мірою псує одержувані результати Найбільш близьким за технічною суттєвістю та досягаємим результатом є спосіб визначення антиендотеліальних антитіл, що полягає в наступному 1 Одержують сироватки досліджуваних людей стандартним способом 2 Отримують брюшні аорти'трупів людей в найближчий час після смерті 3 Відмивають брюшні аорти від крові 4 Відокремлюють препаровкою ендотеліальний та субендотеліальнии слої стінки аорти від інших тканин 5 Виготовляють антиген шляхом водно-сопьової екстракції ендотеліального та субендотеліального слоїв стінки аорти 6 Стандартизують антиген за вмістом білку (400 мг%) 7 Проводять реакцію антиген-антитіло з використанням отриманих сироваток та антигену 8 Реєструють реакцію антиген-антитіло за допомогою стандартних імунологічних методів (Мельников В А , Купаев И А , Липатов И С Противососудистые антитела у женщин с физиологической и осложненной гестозом беременностью // Акушерство и гинекология -1992 -№ 3-7 -С 19-21) Спільними ІСТОТНИМИ ознаками прототипу і способу ,що заявляється, є 1 Одержання сироватки стандартним способом 2 Виготовлення антигену шляхом водносольової екстракції компонентів артеріальної стінки 3 Стандартизування антигена за вмістом білку 4 Проведення реакції антиген-антитіло з використанням отриманих сироваток та антигену 5 Реєстрація реакції антиген-антитіло за допомогою стандартних імунологічних методів Однак, незважаючи на те, що існує принципова можливість визначення антиендотеліальних антитіл зазначеним способом, варто зауважити, що одержувані при цьому результати характеризуються незначним рівнем точності і достовірності Це насамперед пояснюється методикою виготовлення використовуваного антигена, оскільки в якості показника, що документує наявність і рівень антиендотеліальних антитіл, використовуються стандартні імунологічні реакції антиген-антитіло, саме властивості антигену, що використовується в реакції і будуть визначати рівень визначаємих антиендотеліальних антитіл Відомо, ЩО велика КІЛЬКІСТЬ плазмених білків, що характеризуються великою имуногеністтю. пропотівають у судинну стінку, визначаючи найчастіше її білковий склад Використання для готування антигену субендотеліальних шарів судинної стінки приводить до того, що до білкові антигенні детермінанти ендотеліальних клітин будуть штучно забруднюватися плазмовими білками Це буде приводити до того, що при визначенні антиендотеліальних антитіл при наступній реєстрації продуктів реакції антиген-антитіло, до продуктів реакції, що характеризують имунолопчну реакцію між антигенами власне ендотелію, будуть домішуватися продукти реакції між антигенами плазмених білків, що, особливо у випадку різних груп крові, різних антигенних детермінант головного комплексу пстосумісності та інше, між донором, що послужив джерелом судин для готування антигену, і досліджуваним, що значно збільшить визначаючу КІЛЬКІСТЬ антиендотеліальних антитіл В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу визначення антиендотеліальних антитіл шляхом зміни методики виготовлення антигену, що забезпечить підвищення достовірності, точності і відтворюванності результатів дослідження Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення антиендотеліальних антитіл, що полягає в одержанні сироватки стандартним способом, виготовленні антигену шляхом водносольової екстракції компонентів артеріальної стінки, стандартизуванні антигена за вмістом білку, проведенні реакції антиген-антитіло з використанням отриманих сироваток та антигену, реєстрації реакції антиген-антитіло за допомогою стандартних імунологічних методів новим є те, що в якості 35184 антигену використовують ендотеліальний шар артеріальної стінки який відокремлюють від інших компонентів судинної стінки шляхом короткочасного притулення ендотеліальної поверхні до льоду з фосфатного буфера, охолодженого до -10-12°С з наступним відриванням непримерзлих компонентів судинної стінки від примерзлого ендотелію Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються та технічним результатом полягає в наступному найбільш критичним складником, від якого залежить точність і достовірність результатів дослідження, при визначенні антиендотеліальних антитіл є вибір антигену, що використовується в реакції антиген-антитіло Використання нативних людських ендотеліальних клітин для одержання антигену є найбільше оптимальним підходом оскільки при цьому виключається помилка визначення, зв'язана з гетерогенністю антигенного складу використовуваних для готування антигену споріднених клітин або ендотеліальних клітин тварин, що мають споріднені антигені детермінанти Наступною задачею, що виникає при готуванні антигену є ретельне відділення ендотеліальних клітин від інших компонентів судинної стінки, що характеризуються своїм власним антигенним складом, і крім того, містять велику КІЛЬКІСТЬ плазмених білків, що пропотівають з крові, що значною мірою можуть зменшити відторюванність результатів дослідження при готуванні різних зразків антигену Притулення на декілька секунд ендотепіальної поверхи» до охолодженого до -10-12° С льоду з фосфатно-сольового буфера приводить до примерзання і фіксації ендотелію на поверхні льоду Це, но-перше, зупиняє всі метаболічні процеси в ендотелії, запобігаючи його функціональній і як наслідок морфологічній перебудові, що позитивно позначається надалі на результатах дослідження, оскільки дозволяє працювати з найбільше незмінними антигенними детермінантами ендотелію, по-друге - у силу такої структурної особливості артеріальної стінки артерій еластичного типу як наявність внутрішньої еластичної мембрани, при наступному відриванні непримерзлих компонентів артеріальної стінки від крижаної поверхні з фіксованим ендотелієм, розшарування артеріальної стінки здійснюється чітко на межі між ендотелієм і поверхньою внутрішньої еластичної мембрани Ці дані підтверджуються результатами морфологічних досліджень зразків судинної стінки, що були підвергнути описаним маніпуляціям Таким чином, цілком виключається залучення субендотеліальних слоїв судинної стінки в готуємий антиген, що значно підвищує точність, достовірність і відтворюванність результатів дослідження Для визначення показника норми було обстежено 82 людини, з них 48 практично здорових осіб, 34 хворих на гіпертонічну хворобу різних стадій захворювання у ВІЦІ від 17 до 73 років (середній вік склав 40,3±10,9 років), з них жінок було 45,83%, ЧОЛОВІКІВ - 54,17% Після визначення у здорових осіб антиендотеліальні антитіла в реакції зв'язування комплементу були визначені в титрі 1 5 Спосіб здійснюється слідуючим чином 1 Одержують сироватку стандартним способом 2 Отримують брюшні аорти трупів людей в найближчий час після смерті 3 Відмивають брюшні аорти від крові 4 Розрізують аорти на сегменти довжиною 3-4 см 5 Розрізують вздовж отримані аортальні сегменти 6 У посуд з невисокими бортами наливають розчин фосфатно-сольового буфера та заморожують 7 Охолоджують отриману кригу до температури-10-12°С 8 До охолодженої криги притуляють ендотеліальну поверхню аортальних клаптиків на 2-3 секунди 9 Різким рухом відривають фіксований на крижаній поверхні ендотеліальний шар від інших компонентів судинної стінки 10 Помішують посуд у холодильник при температурі 4°С до розтавання криги 11 Гогоменезують у розталому фосфатносольовому буфері ендотелій 12 Проводять водно-сольову екстракції компонентів артеріальної стінки впродовж 18-20 годин 13 Стандартизують антиген за вмістом білку 14 Проводять реакцію антиген-антитіло з використанням отриманих сироваток та антигену 15 Реєструють реакцію антиген-антитіло за допомогою стандартних імунологічних методів Приклад Хворій С . 43 років, надійшов в кардіологічне відділення Запорізької обласної клінічної лікарні з скаргами на запаморочення, головний біль, «МІЛЬТІШИННЯ цяток» перед очами, дзвін в вухах, задишку при фізичному навантаженні Вважає себе хворим протягом 8 років, коли вперше, без видимої причини, було зареєстровано носову кровотечу, яка супроводжувалася підвищенням артеріального тиску до 190 та 120 мм рт ст Згодом хворий неодноразово знаходився на стаціонарному лікуванні з приводу гіпертонічної хвороби, одержував амбулаторну терапію р-блокаторами і діуретиками За тиждень до надходження в клініку після сильного псіхоемоційного потрясіння, з'явилися вищезазначені скарги на тлі високих цифр артеріального тиску (до 1801 110 мм рт ст), і хворий був госпіталізований для купіровання гіпертонічного криза та корекції проводимо» терапи Анамнез життя - без особливостей, мати хворого страждала гіпертонічною хворобою, іншої спадкової патологи в родині не виявлено Пацієнт палить протягом 13 років, ІНШІ ШКІДЛИВІ звички заперечує, алергологічний анамнез не обтяжений Об'єктивно спостерігаються наступні зміни Артеріальний тиск в момент надходження 180 і 100 мм рт ст на ЛІВІЙ І 185 І 110 мм рт ст на правій-плечових артеріях, пульс 84 ударів в хвилину, задовільних властивостей При пальпації верхівний поштовх визначається на 2-2,5 см ззовні від середньоключичної лінії з лівої сторони в 6 міжребірьі, поширений, збільшений по висоті, посилений Перкуторно - розширення границь відносної серцевої тупості, аускультативно - ДІЯЛЬНІСТЬ серця правильна, посилений І тон на верхівці серця, в легенях дихання везикулярне, жорсткувате, в нижніх відділах з обох сторін одиничні вологі дрібнобулькасті неконсонуючі хрипи Частота дихання 20 в 1 хвилину, дихання поверхневе На електрокардіограмі - ознаки ппертро 35184 фіі міокарда лівого шлуночка, порушення процесів реполярізації в лівих грудних відведеннях. При ехокардіографічному дослідженні спостерігається збільшення кінцеводіастолічного і кінцевосістоліч-* ного об'ємів лівого шлуночка, помірне зниження його скорочувальних властивостей, потовщення задньої стінки лівого шлуночка та міжшлуночкової перетинки, наявна гіпертрофія міокарда' лівого шлуночка (індекс маси міокарда лівого шлуночка 123 г/м3). При рентгенологічному дослідженні в легенях посилений судинний малюнок, корені структурні, тяжисті, більше з правої сторони. При дослідженні очного дна визначається звуження і склерозування артерій, вени повнокровні, поширені, феномен Салюса-Гуна ІІ-ІІІ ступеня. Дані інших інструментальних та лабораторних досліджень без особливостей. Враховуючи скарги хворого, клінічну картину захворювання, дані об'єктивного дослідження і зважаючи на результати додаткових способів дослідження, хворому був поставлений клінічний діагноз - гіпертонічна хвороба, И стадія. Враховуючі часту асоціацію порушення функції ендотелію з появою антиендотеліальннх антитіл та підвищення артеріального тиску, з метою оптимізації застосовуємої протигіпертензиеиої терапії, у хворого був визначений рівень антиендотеліальних антитіл. Сироватка була отримана загальноприйнятим способом. В якості антигена використовували водно-сольовий екстракт ендотеліального та субендотеліального шару судинної стінки, отриманий з аорти людини з першою резус-негативною групою крові в перші години після смерті, яка померла від випадкових причин. Визначення рівня антиендотеліальних антитіл проводили за допомогою реакції зв'язування комплементу. Результати аналізу свідчили, що в використаній системі внаслідок утворення комплексу антигенантитіло було зв'язано 5 2 % комплементу, що свідчило про значну кількість антитіл в реакційній суміші, яке значно перевищувало можливу межу рівня антитіл і вказувало на наявність у досліджуємого значної аутосенсибілізацГї. Враховуючи, що розвиток гіпертонічної хвороби супроводжується розвитком порушень в системі обміну коллагену, було припущено, що напрочуд великий рівень антиендотеліальних антитіл, визначений вказаним способом, зу мовлюється забрудненням виготовленого антигену білками сполучної тканини, які потрапляють з субендотеліаль-ного шару судинної стінки в процесі виготовлення антигену. Для з'ясування цього припущення, були визначені антиколагенові та антиеластинові антитіла з очищеними препаратами колагену та еластину стандартними способами. Результати дослідження свідчили про значне перевищення рівня зв'язування комплементу комплексом «антитіло-колаген» (28%) та «антитіло-еластин» (22%) у хворого проти результатів практично-здорових осіб (14% та 16% відповідно). Тобто визначення рівня антиендотеліальних антитіл було хибним, що могло би привести до помилкового діагнозу у досліджуємого. Одночасно з вищезгаданим способом було проведено визначення антиендотеліальних антитіл згідно способу, що пропонується, який дозволяє найбільш повно провести відокремлення ендотеліального шару судин від прилеглих тканин та попереджує забруднення препарату антигену плазменими білками. Як індикатор реакції антиген-антитіло була також використана реакція зв'язування коплементу, згідно якої рівень зв'язування ком лементу склав 26%. .і Таким чином використання запропонованого способу визначення антиендотеліальних антитіл дозволило попередити діагностичну помилку і сприяло покращенню процесу лікування хворого з використанням ендотелій-протекторних препаратів. Через 12 тижнів комплексного лікування, при контрольному обстеженні поряд з поліпшенням клінічної картини захворювання та позитивною динамікою даних інструментальних досліджень, спостерігалося достовірне зменшення вмісту антиендотеліальних антитіл, які при реакції з антигеном, виготовленим згідно запропонованому способу, зв'язували 14% комплементу. Таким чином, використання способу, що пропонується, дозволило вчасно визначити* ступінь залученості ендотелі-альних клітин в патологічні імунологічні реакції, в яких продукуються аитиендоте-ліальні антитіла, попередило хибне визначення аутоімуних розладів, дозволило призначити патогенетично зумовлену терапію, що в підсумку призвело до підвищення якості діагностики, дозволило оптимізувати лікування і відвернути появу ускладнень. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3